不同喂养方式对婴儿肠道菌群的影响

王小卉,杨毅,徐秀,郭志平,邵彩虹　(复旦大学附属儿科医院内科,上海　200032)

中图分类号:R725.7　　文献标识码:A

作者简介:王小卉(1969-),女,上海人,主治医师,硕士在读,主攻方向为小儿消化系统疾病。

　　摘　要:　【目的】　通过观察健康婴儿母乳及配方乳两种不同喂养方式下肠道菌群的定植过程,分析婴幼儿饮食与肠道菌群形成的关系并探讨其意义。　【方法】　采用荧光定量PCR技术测定细菌16S rRNA,经与标准曲线对照计算细菌数量,对71名母乳喂养婴儿和60名人工喂养婴儿粪便中乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌进行了定量检测。　【结果】　婴儿肠道菌群处于动态定植过程。母乳喂养婴儿肠道乳酸杆菌、双歧杆菌数量较人工喂养婴儿高(P< 0.05),而大肠杆菌数量较人工喂养婴儿低(P< 0.05)。　【结论】　荧光定量PCR法定量测定肠道菌群的数量是一种简便、快捷、特异性好的方法。婴儿期肠道菌群仍处于动态演替过程。不同的喂养方式对肠道菌群有影响,应大力提倡母乳喂养。

关键词:　喂养方式;肠道菌群;婴儿

Influence of different feed fashion on intestinal microflora in infants

. WANG Xiao-hui,YANG Yi,XU Xiu,GUO Zhi-ping,SHAO Cai-hong

.(Department of Internal Medicine, Children' s Hospital ofFudan University, Shanghai 200032,China)

Key words:　formula-fed; intestinal microflora; infants;

　　肠道细菌的定植始于分娩的整个过程,但微生物生态系的建立是一个在生后几年内才完成的缓慢渐进的动态演变过程[1]。许多因素可影响肠道正常菌群的建立和构成,如喂养方式、分娩方式、胎龄、卫生状况、地理环境及抗生素的应用[2]。母乳喂养的婴儿通常比奶瓶喂养婴儿更能够有效地避免多种感染如腹泻、败血症、尿路感染,从而降低婴儿死亡率[1]。这种保护作用可能与母乳对肠道微生物群的组成有关。为此,作者采用16S rRNA荧光定量PCR法检测正常健康婴儿在不同的喂养方式下肠道菌群主要组成成份数量(双歧杆菌、乳酸杆菌和大肠杆菌),探讨不同喂养方式对婴儿肠道菌群定植的影响,进而从肠道微生态的角度阐述母乳喂养的价值。

1　对象和方法

1.1　对象　均来自复旦大学附属医院儿保健康体检

婴儿,其胎龄、分娩方式、出生体重、卫生状况等基本一致,均无腹泻和急、慢性疾病,采样前4周内均未服用过微生态制剂(包括酸奶)及抗生素。其母也无用抗生素史。母乳喂养组为71例健康母亲顺产的足月健康儿,男40名,女31名;人工喂养组为60名健康母亲顺产的足月健康儿,男34名,女26名。两组婴儿添加辅食的时间、种类和顺序差异无显著性。分别在生后1、2、6、9月采集粪便标本。

1.2　方法

1.2.1　标本处理　取新鲜大便(1～ 4 h内)1 g加9ml PBS(0.05 M,pH 7.4),充分振荡混匀5～ 10 min,然后低速离心(1 500 r/min)5 min,取上清液,重复3次,高速离心(9 000 r/min)3 min,沉淀的细菌用PBS液洗4次,水洗1次。加0.1 ml蒸馏水悬浮,以1%TritonX-100破碎菌体,DNA煮沸5 min,立即放入冰水中冷却备用。

1.2.2　PCR引物设计　利用Primer Premier 5引物设计软件,在各细菌属16S rRNA序列特异性区域设计上下游引物。见表1。

1.2.3　荧光定量PCR　50μl反应体系包括:10×Buffer 5μl,4× dNTP(10mM)1μl,上下游引物各1μl,模板5μl,Taq酶0.5μl,荧光染料SYBR green I 1μl,水35.5μl。采用ABI7000型实时荧光PCR仪(美国生物应用公司产品)进行扩增与分析,94℃变性3 min后,各细菌循环参数:双歧杆菌94℃ × 20 sec,60℃ ×1 min;乳酸杆菌94℃ × 20 sec,58℃ × 20 sec,72℃ ×30 sec;大肠杆菌94℃ × 20 sec,55℃ × 25 sec,72℃ ×30 sec,40个循环。取准确定量的细菌DNA(双歧杆菌、乳酸杆菌由上海信益药厂提供,大肠杆菌本院保存)做系列稀释后同时进行PCR反应,作为标准曲线。

1.3　统计学分析　所得结果以 x± s表示,各组间比较用t检验,求出P值。

2　结　果

2.1　1～ 9个月健康婴儿三种主要肠道菌群数量的变化　健康婴儿生后1个月时肠道已有双歧杆菌定植,并随着生长发育数量不断增加,尤其在6月龄时迅速增至1月龄时的5倍(P< 0.01),其始终为肠道的优势菌群。乳酸杆菌也在1月龄时已定植于肠道,其数量虽少于双歧杆菌,但呈稳定增长的变化。在婴儿期大肠杆菌的数量远低于双歧杆菌和乳酸杆菌,并呈现减少的变化趋势,与1月龄时相比差异有显著意义(P< 0.01),在6个月时降至最低,9个月时有所回升。双歧杆菌与大肠杆菌的比值(B/E)也随生长而升高,在6月龄时最高,与1月龄组相比差异有显著性(P<0.05)。见表2。

表1　PCR引物序列

细菌基因编码引物序列(5'～ 3')产物(bP)

双歧杆菌137～ 159 AGAACCTAACCTGGGCTTGAGA

268～ 251 CGCTCGCGGGACTTA 132

乳酸杆菌623～ 640 CTGATGTGAAAGCCCTCG

788～ 771 GAGCCTCAGCGTCAGTTG 166

大肠杆菌1 262～ 1 279 GCAAGCGGACCTCATAAA

1 366～ 1 349 ATTCACCGTGGCATTCTG 105

表2　母乳喂养婴儿肠道菌群检测结果(log拷贝数/g湿粪)　( x± s)

项目1月(n= 20) 2月(n= 25) 6月(n= 15) 9月(n= 11)

双歧杆菌9.61± 1.06 9.70± 1.11 10.35± 1.07＊ 10.38± 0.81＊

乳酸杆菌8.90± 1.66 9.18± 1.75 9.32± 1.54 9.42± 1.39

大肠杆菌8.69± 2.03 8.28± 1.68 7.20± 1.79■ 8.01± 1.59

B/E比值1.17± 0.31 1.32± 0.45 1.53± 0.48 1.34± 0.29

　　注:＊与1月比较P< 0.05;■与1月比较P< 0.01;B/E比值即双岐杆菌与大肠杆菌的比值。

2.2　不同喂养方式及断奶后健康婴儿三种主要肠道菌群的变化　母乳喂养的婴儿1月龄时双歧杆菌数量较同年龄人工喂养组高(P< 0.05),并且这种趋势一直保持到断奶。母乳喂养的婴儿1月龄时乳酸杆菌数量也较同年龄人工喂养组高(P< 0.05),2月龄及断奶后母乳喂养的婴儿较同年龄人工喂养组乳酸杆菌高。母乳喂养的婴儿大肠杆菌数量较同年龄人工喂养儿低,断奶后依然保持这种趋势。母乳喂养婴儿双歧杆菌与大肠杆菌的比值(B/E)在断奶前及断奶后均较人工喂养儿高。见表3。

表3　不同喂养方式及断奶前后肠道菌群比较

　　　　　　　　　　　(log拷贝数/克湿粪) ( x± s)

项　目　 1月龄母乳组人工组t值P值

双歧杆菌1 9.29± 1.06 8.63± 1.15 1.86 < 0.05

2 9.70± 1.11 9.07± 1.10 1.98 < 0.05

断奶10.35± 1.07 9.16± 1.02 3.31 < 0.01

乳酸杆菌1 8.90± 1.66 8.01± 1.42 1.77 < 0.05

2 9.18± 1.75 8.60± 1.45 1.25 > 0.05

断奶9.32± 1.54 8.77± 1.12 1.21 > 0.05

大肠杆菌1 8.69± 2.03 9.57± 1.35 1.54 > 0.05

2 8.28± 1.68 9.16± 1.13 2.11 < 0.05

断奶7.20± 1.79 8.27± 1.35 1.99 < 0.05

B/E比值1 1.17± 0.31 0.91± 0.34 2.48 < 0.01

2 1.32± 0.45 1.04± 0.20 2.70 < 0.01

断奶1.34± 0.29 1.14± 0.23 2.25 < 0.05

　　注:母乳组与人工组1月龄时婴儿数分别为20,18;2月龄时分别为25,23;断奶时为15,19。

3　讨　论

肠道菌群数量庞大,构成复杂,共50多属、500多种细菌,1012～ 14个(每g肠内容物)双歧杆菌、乳酸杆菌、消化道链球菌等专性厌氧菌约占肠道总菌量的99%,肠杆菌、肠球菌等兼性厌氧菌约占总菌量的1%[6]。作者选取了双歧杆菌、乳酸杆菌为专性厌氧菌代表,大肠杆菌作为兼性厌氧菌的代表,分析了婴儿肠道菌随生长及饮食构成不同的变化,为今后有关婴幼儿肠道微生态的进一步研究提供了参考数据。

3.1　婴儿肠道菌定植过程　新生儿出生后不久,肠道内即有大量细菌定植,1周左右大部分菌群达到初步演替平衡[4],但微生物生态系的建立是一个在几年内才完成的缓慢渐进的动态演变过程,而婴儿期是肠道菌群快速演替的重要阶段。该研究显示正常健康婴儿在1月龄时,双歧杆菌为优势菌,同时还含有大量的大肠杆菌和乳酸杆菌。随生长发育双歧杆菌数量略有增加,仍为优势菌。乳酸杆菌逐渐增加,而大肠杆菌在6个月时明显下降,以后相对平稳。

3.2　喂养方式对对肠道菌群的影响　许多因素可影响肠道正常菌群的建立和构成,如地理环境、分娩方式、喂养方式、胎龄、卫生状况及抗生素的应用。HYoshioka等[6]对不同喂养方式儿童肠道菌群的研究发现,无论是母乳喂养儿或人工喂养儿最初定植的都是需氧菌,而后是厌氧菌。在母乳喂养儿中双歧杆菌增长迅速,生后第6 d时成为优势菌,双歧杆菌/肠杆菌≈ 1 000∶1,而人工喂养儿中生后第6 d双歧杆菌仍然不是优势菌,双歧杆菌:肠杆菌≈ 1∶ 10,且其他细菌如肠杆菌、类杆菌、肠球菌较母乳喂养儿高。其原因是母乳有促进双歧杆菌生长,抑制大肠杆菌和潜在致病菌生长的功能,帮助婴儿避免因这些致病菌感染而致的疾病。因此,母乳喂养较人工喂养具有更强的抗病能力。研究也发现母乳喂养的婴儿肠道内含有更多的双歧杆菌,而大肠杆菌数量低(P< 0.05),这种情况一直保持到断奶后。双歧杆菌等专性厌氧菌可通过产生酸性代谢降低肠道PH值及氧化还原电势、产生具有广谱抗菌活性的甲醇-丙酮抽提物质等方式对肠道兼性厌氧菌等潜在致病菌的生长起拮抗作用。也有人提出B/E比值可作为肠道定植力的指标,并认为B/E<1表示肠道定植力受损[7]。研究还表明,人工喂养组B/E较母乳喂养组明显降低,表明肠道定植力减弱,抵抗病原菌侵袭能力降低易于引起感染。

3.3　不同喂养影响肠道菌群的可能机制　母乳中存在的某些成份对婴儿肠道菌群的定植有影响,双歧因子可利于双歧杆菌、乳酸杆菌生长,乳铁蛋白通过对铁离子的竞争而抑制大肠杆菌生长。分泌型IgA对大肠杆菌和致病菌有抑制作用。而双歧杆菌、乳酸杆菌能够通过免疫排斥、免疫清除、免疫调节加强胃肠道防御的各个防线,发挥抗感染、抗炎症的作用[5,8]。母乳喂养能通过促进双歧杆菌、乳酸杆菌益生菌的生长而发挥抗感染及抗过敏的作用。因此,母乳喂养是婴儿最自然、最合理的喂养方式,应大力提倡母乳喂养。此外,荧光定量PCR法具有PCR技术敏感性高、特异性强、操作简单、快速的优点,又克服了PCR反应过程中易受污染造成假阳性的缺点,为定量测定肠道菌群提供了一种简便、快捷、特异性好的方法。

[参考文献]

　[1]　INGEGERD ADLERBERTH.新生儿肠内正常微生物群的确立[C].第42届雀巢营养国际研讨会,2002,5-7.

　[2]　张　琳.婴幼儿肠道正常菌群的演变及影响因素的研究[C].全国微生态学第八届学术讨论会论文集,2002,273-276.

　[3]　DUFFY LC,LEAVENS A,GRIFFITHS E,et al.Perspectives onbifidobacteria as biotherapeutic agents in gastrointestinal health[J].Dis Sci,1999,44:1499-1505.

　[4]　闻玉梅.现代医学微生态学[ M].上海:上海医科大学出版社,1999.97-111.

　[5]　GRONLUND MM, ARVILOMMI H. Importance of intestinalcolonisation in the maturation of humoral immunity in early infan-cy:a prospective follow up study of healthy infants aged 0～ 6months[J].Arch Child Fetal Neonatal Ed,2000,83:186-192.

　[ 6]　YOSHIOKA H,ISEKI K,FUJITA K. Development and differ-ences of intestinal flora in the neonatal period in breast-fed and bot-tle-fed infants[J]. Pediatrics,1983,72(3):317-321.

　[7]　吴仲文,李兰娟,马伟航,等.肠道菌群正常参考值的检测[ J].中国微生态学杂志,2001,13(5):314-315.

　[8]　蓝景刚,胡　宏.双歧杆菌的免疫调节作用研究进展[ J].中国微生态学杂志,2002,14(2):119-122.