孤独症AUTS2基因罕见变异筛选及其对鼠神经元树突发育的影响

王啥  林芬  王琳彦  张天  汪子琪  卢天兰  贾美香  李俊  刘靖  王力芳

(北京大学第六医院，北京大学精神卫生研究所，国家卫生健康委员会精神卫生学重点实验室(北京大学)，国家精神心理疾病临床医学研究中心(北京大学第六医院)，北京100083通信作者：刘靖)

【摘要】目的：探讨中国汉族孤独症患者是否携带孤独症易感候选基因2(AUTS2)有害罕见变异，及其对鼠神经元树突发育的影响。方法：对96例符合DSM-IV孤独症诊断标准的中国汉族孤独症患者AUTS2基因进行靶向测序筛选罕见变异，进一步扩大样本在766例孤独症患者和864例正常对照中采用Sanger测序法进行验证，继而构建有害罕见变异质粒，转染至敲低内源性4心2的原代培养SD乳鼠皮层神经元，观察神经元树突总长度和分支数量。结果：AUTS1基因2个罕见错义突变c.44G>T(Argl5Leu)和c,1774C>G(Pro592Ala)仅孤独症患者携带，功能预测为有害突变。此2个罕见错义突变导致SD乳鼠皮层神经元顶树突和基树突的总长度和分支数量均显著减少(P<0.05)。结论：中国汉族人群孤独症AUTS2基因存在2个有害罕见错义突变，能影响大鼠神经元树突发育，可能参与孤独症的发病。

【关键词】孤独症；AUTS2基因；罕见变异；神经元；树突发育

中图分类号：R749.94文献标识码：A文章编号：1000-6729(2021)004-0338

[基金项目：国家重点研发计划(2017YFC1309901),广东省重点领域研发计划(2O19BO3O335OO1),国家自然科学基金(81671363),国家自然科学基金(81971283)

前言

孤独症是一种严重的神经发育障碍，核心症状为社会交往损害、交流障碍、重复及刻板的兴趣和行为。该病全球患病率约为1%⑴。孤独症病因尚不完全明确，家系及双生子等研究认为遗传因素在孤独症病因中发挥重要作用。该病遗传度高，约为64%-91%⑵。

孤独症易感候选基因2(AutismSusceptibilityCandidate2,AUTS2)位于染色体7qll,最初在孤独症同卵双生子发现该染色体区域的平衡易位，染色体的断裂点导致AUTS2基因被破坏⑶。AUTS2基因主要在胎儿脑额叶、顶叶和颛叶高度表达⑶。Autsl基因参与调节发育期小鼠大脑皮层神经元迁移和轴树突形成过程⑷。神经元树突发育等早期神经发育异常对神经元网络的建立具有广泛而持久的影响，可能导致脑部神经环路和神经信号传递障碍及孤独症样表现⑸。因此，AUTS2基因可能影响神经元树突发育，进而参与孤独症致病。

多项研究发现部分孤独症患者携带AUTS2基因潜在致病性的拷贝数变异S。】，该基因被认为是孤独症的易感基因。孤独症遗传病因复杂且具有较高的异质性，相关遗传变异存在多种形式，其中罕见变异占孤独症病因的10%~30%⑻。罕见变异发生频率较低，但可能影响基因表达和蛋白质功能，进而参与孤独症的致病过程。因此，筛选有害罕见变异有助于进一步了解孤独症的遗传学病因。目前At/TS2基因罕见变异的相关研究较少，中国汉族人群孤独症尚缺乏对AUTS2基因罕见变异的研究。因此本研究在中国汉族儿童孤独症患者中筛选4U馈基因罕见变异，并进一步探讨其对鼠神经元树突发育的影响。

1对象与方法

1.1对象

本研究根据罕见变异最小等位基因频率估算靶向测序所需样本量“幻。按照N=n/M计算靶向测序所需样本量，N为所需样本量，n为携带罕见变异的样本例数，M为罕见变异位点最小等位基因频率。按几=1、M=5%计算，检出1例罕见变异所需样本量为20例。按"=1、M=l%计算，检出1例罕见变异需要约100例孤独症患者。本研究前期筛选罕见变异的样本量为96例，可筛査出最小等位基因频率为1%~5%的罕见变异。

儿童孤独症患者招募于北京大学第六医院门诊。诊断均符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders,FourthEdition,DSM-IV)［13］孤独症的诊断标准，由2名儿童精神科副主任医师进行诊断；同时满足孤独症行为量表53分及儿童孤独症评定量表(ChildhoodAutismRatingScale,CARS)>36分'⑷。孤独症组排除患有阿斯伯格综合征和未特定广泛性发育障碍者；排除患有苯丙酮尿症、脆性X染色体综合征、结节性硬化或其他神经系统疾病者及患有严重躯体疾病和染色体异常患者。同期招募健康汉族儿童作为正常对照组，由精神科医师采用非结构式临床访谈明确无精神障碍，排除既往有精神疾病史、重大躯体疾病及精神神经疾病家族史。本研究前期招募96例孤独症儿童患者［男孩80例(83.3%),女孩16例(16.7%),年龄中位数4.7(3.0,14.4)岁］。此后扩大样本进一步招募766例孤独症患者，其中男性681例(88.9%),女性85例(11.1%),年龄中位数4.9(3.0,16.7)岁。同期招募健康汉族儿童864例，其中男性768例(88.9%),女性96例(11.1%),年龄中位数3.1(3.0,7.0)岁。孤独症组与正常对照组儿童性别差异无统计学意义。本研究获北京大学第六医院伦理委员会批准。所有孤独症和正常儿童监护人均签署知情同意书。

功能研究采用出生当天（P0）的SD乳鼠进行神经元培养，相关实验操作均遵照北京大学医学部动物使用管理条例。

1.2工具

1.2.1孤独症行为量表（ABC）g®w

用于孤独症儿童的筛查，由父母（要求与被测儿童至少共同生活3~6周）或教师（至少生活半年）评定，共包括感觉、交往、躯体运动、语言及自我照顾5个因子。总分53分以上提示患有孤独症。该量表中文版信度和效度均较好。

1.2.2儿童孤独症评定量表（CARS）g”。次

用于评估儿童孤独症相关症状。由医师或儿童心理测验专职人员从15个主要方面进行评估。总分大于30分可考虑为孤独症，30-36分为轻-中度孤独症，大于36分并且5项以上达3分或大于3分时为重度孤独症。该量表中文版信度和效度均较好。

1.3实验方法

1.3.1靶向测序、Sanger测序及罕见变异功能预测外周静脉血釆用血液基因组DNA提取试剂盒（Qiagen公司）提取DNA。首先对96例孤独症DNA样本的AUTS2基因进行靶向测序。测序范围为所有外显子及启动子区上游1Kb和如非编码区（untranslatedregion,UTR）1Kbo测序采用北京博奥公司的NimbleGen靶向序列捕获技术，通过niuminaHiSeq2500平台完成。对原始数据进行质控过滤，使用Burrows-WheelerAligner（BWA）软件与人类基因组参考序列（GRCh37）进行比对回帖通过GenomeAnalysisToolkit（GATK）识别样本序列与参考基因组序列之间的差异并进行注释，寻找变异位点“们。

扩大样本并采用Sanger测序法对靶向测序发现的罕见变异进一步验证。采用2xEasyTaqPCRSuperMix（包括EasyTaqDNA聚合酶、dNTP和缓冲液）加入样本DNA进行聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）oPCR产物通过测序仪（AppliedBiosystem）进行测序。采用SIFT、PolyPhen2和MutationTaster三种预测软件对发现的罕见变异致病性进行预测。

1.3.2质粒构建

将人源AUTS2基因的cDNA序列构建入pCAG-IRES-EGFP载体。将shRNA识别@标序列5-TGACAGAGATAGAGATGTA-3，构建入pSUPER载体"刀,敲低SD乳鼠皮层神经元内源性Auts2基因表达。该shRNA也可干扰人源AUTS2基因的表达，因此需构建抗干扰的人源AUTS2质粒；抗干扰AUTS2质粒引物：上游引物：5^TGCAGCT-CATGATAGGGACAGGGACGTAGATAAACGAGAC-3；下游引物：5-GTCTCGTTTATC-TACGTCCCTGTCCCTATCATGAGCTGCA-3；继而在抗干扰人源AUTS2质粒的基础上，针对仅在儿童孤独症患者中发现的2个罕见错义突变，采用QuikChangeLightningSite-DirectedMutagenesis试剂盒（AgilentTechnologies）构建错义突变质粒mut44（c.44G>T,ArglSLeu）和mutl774（c.1774C>G,Pro592Ala）。mut44引物：上游引物：5-GCAAAAAGCGGCTGTCGCGGTCG-CAGCGAGAC-3；下游引物：5-TGCGACCGCGA-CAGCCGCTTTTTGCGGAGTCC-3；mutl774引物：上游引物：5：CGGGCATCCCCGCTATGATCCCA-3；下游引物：5^TGGGATCATAGCGGGGATGC-CCG-3；

1.3.3鼠神经元原代培养和质粒转染

解剖P0新生SD乳鼠皮层，0.25%胰蛋白酶消化，分离成单细胞，以3xl05个细胞/孔接种至24孔板，用含有B27和Glutamax的Neurobasal培养液进行培养。培养至第4天，采用磷酸钙转染法进行质粒转染，对照组：pCAG+pSUPER+Venus；干扰组：pCAG+shRNA+Venus；挽救组：抗干扰AUTS2-wt+shRNA+Venus；mut44组：抗干扰AUTS2-mutA4+shRNA+Venus；mutl774组：抗干扰At/7S2-mutl774+shRNA+Venus0Venus质粒为含有2个EGFP拷贝的表达质粒，共转该质粒可用于标记神经元的树突形态特征。转染后继续培养至第7天。

1.3.4神经元树突形态观察

神经元经固定、封闭后，进行免疫组化染色。选取各组玻片中神经元（30个/组），在荧光倒置显微镜下观察神经元树突形态。采用Image-ProPlus软件分别测量各组神经元顶树突和基树突的总长度，以及计数各组神经元顶树突和基树突的分支数量。

1.4统计方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料，采用(均数土标准差)描述;不符合正态分布的计量资料，采用；中位数(最小值，最大值)］描述。计数资料用例数(%)表示，以四格表/检验比较组间差异，理论频数<5且>1时，采用连续校正寸检验。神经元树突总长度和分支数量各组结果用单因素方差分析；方差齐，采用最小显著差法(LSD)进行事后检验两两比较；方差不齐，采用塔姆黑尼法［T2(M)］进行事后检验两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1靶向测序、扩大样本验证及罕见变异功能预测

96例儿童孤独症靶向测序结果显示AUTS2基因中发现6个罕见错义突变：C.44G>T(Argl5Leu)、rsl99945820(Pro63Gln)、rsl45480547(Leul29Val)、c.778G>A(Val260He)、rsl50891487(Pro342Leu)和c.1774C>G(Pro592Ala)，这些变异均为杂合型。具体信息见表1。

扩大样本进一步验证上述6个罕见错义突变,儿童孤独症总样本数达到862例和正常对照总样本数为864例。验证结果显示位于第1和第11外显子的2个罕见错义突变c.44G>T(Argl5Leu)和c.1774C>G(Pro592Ala)仅孤独症患者携带，突变频率均为0.12%(1/862),正常对照组中未发现；功能预测此2个错义突变为有害。另外4个罕见错义突变在孤独症组和正常对照组均存在(见表1)。突变频率在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)表1AUTS2基因罕见错义突变及其功能预测2.2AUTS2基因2个罕见错义突变对鼠神经元树突形态的影响

干扰组皮层神经元与对照组相比，顶树突总长度［(612.0±28.6)p,mvs.(917.0±46.2)/xm］,基树突总长度［(359.1±26.9)punvs.(716.9±37.5)gm］,顶树突分支数量［(10.6±0.6)个vs.(16.4±1.0)个］,基树突分支数量［(9.8±0.5)个vs.(17.0±0.6)个］均减少，差异有统计学意义(P<0.001)。

挽救组与干扰组相比，皮层神经元顶树突总长度［(809.5±39.3)jumvs.(612.0±28.6)pan］增加，差异具有统计学意义(P<0.01);基树突总长度［(598.8±28.7)pinvs.(359.1±26.9)/xm)］,顶树突分支数量［(15.5±0.8)个vs.(10.6±0.6)个］,基树突分支数量［(15.8土0.7)个vs.(9.8±0.5)个］均增加，差异有统计学意义(P<0.001)。

2个错义突变［c.44G>T(Argl5Leu)和c.1774C>G(Pro592Ala)］转染组分别与挽救组相比，皮层神经元顶树突总长度［(402.0±24.7)p,mvs.(809.5±39.3)g,m；(586.4±55.4)/j,mvs.(809.5±39.3)/im］,基树突的总长度［(328.2±20.5)fimvs.(598.8±28.7)四m；(394.7±28.9)gmvs.(598.8±28.7)呻］,顶树突分支数量［(7.7±0.5)个vs.(15.5±0.8)个；(10.2±0.8)个vs.(15.5±0.8)个］,基树突分支数量［(10.7±0.5)个vs.(15.8±0.7)个；(10.9±0.6)个vs.(15.8±0.7)个］均减少，差异具有统计学意义(P<0.05)。统计分析结果见图1。

3讨论

本研究对中国汉族儿童孤独症患者AUTS2基因转录调控区域和编码区进行测序，发现该基因位于外显子的2个罕见错义突变c.44G>T(Argl5Leu)和c.1774C>G(Pro592Ala)仅孤独症患者携带。将此2个罕见错义突变质粒转染SD乳鼠原代皮层神经元，其树突总长度和分支数量均显著减少。对照组干扰组挽救组mut44组mutl774组

注：对照组，pCAG+pSUPER+Venus；干扰组，pCAG+shRNA+Venus；挽救组，抗干扰AUTS2-wt+shRNA+Venus；mut44组，抗干扰4C/TS2-mut44+shRNA+Venus；mutl774组，抗干扰/l[/rS2-mutl774+shRNA+Venuso每组30个神经元，数据以(均数士标准差)表示。*P<0.05,**F<0.01,***P<0.001。图1AUTS2基因2个罕见错义突变对鼠神经元树突总长度和分支数量影响

本研究仅在孤独症患者中发现的AUTS2基因2个罕见错义突变发生频率较低；位于编码区和/或非编码区的罕见变异虽然频率较低，但影响蛋白质的功能和基因的表达，可能具有致病性。罕见变异的发现增进和丰富了对孤独症遗传学病因的认识。有研究提示，低功能孤独症患者的遗传病因可能主要由具有高度外显性的罕见突变引起；罕见突变可导致特定基因的编码改变，这些特定基因的功能呈现通路富集'叫。因此，筛选罕见突变有助于探讨罕见变异位点及所在基因的功能，进一步探讨孤独症的致病机制。国外研究报道1例患有孤独症和唇腭裂的患者携带AUTS2基因的罕见变异。此外，全外显子测序研究发现语言发育障碍患者携带AUTS2基因罕见变异c.C349T(p.R117C)[201o本研究在中国汉族孤独症患者中未发现上述罕见变异，与既往研究并不完全一致，可能与孤独症具有较高的遗传异质性以及不同种族的遗传背景差异有关。

既往尸脑研究发现孤独症患者的皮层神经元树突棘发育异常与正常对照组相比，孤独症患者海马神经元树突分支和长度均减少⑵〕。因此，AUTS2基因2个罕见错义突变可能通过影响神经元树突发育，进而参与孤独症致病。小鼠胚胎期神经发育过程中，彳*2基因以两种不同剪接体编码蛋白分别在细胞核和细胞质中表达0位于细胞核的AUTS2蛋白作为转录激活因子与Polycomb复合物1结合并调控关键基因的转录从而影响神经发育;细胞质中AUTS2蛋白通过激活Rho家族的Rael调控肌动蛋白的动力学功能，进而参与皮层神经元树突形成和神经元迁移过程⑷。本研究发现的AUTS2基因2个罕见错义突变[c.44G>T(Argl5Leu)和c.1774C>G(Pro592Ala)]是否通过上述机制影响神经元树突发育进而参与孤独症发病过程，尚需深入探索。

总结

本研究仍存在一些不足。如样本量相对较小，后续将进一步扩大孤独症样本量筛选AUTS2基因罕见变异。此外，AUTS2基因2个罕见错义突变影响神经元发育的分子机制有待进一步研究。构建AUTS2基因罕见变异敲入小鼠模型更有助于深入探索罕见变异功能及对小鼠行为表型的影响。

综上所述，本研究发现中国汉族孤独症患者40752基因存在2个有害罕见错义突变；此2个有害罕见错义突变影响大鼠神经元树突发育，可能参与孤独症的发病。