里程碑式的基因疗法直接靶向修复大脑神经元缺失的功能

星期三，夜空明朗。

即使心理干预被循证为治疗孤独症核心问题的唯一手段，也不过是无奈之举。人们对其它治疗手段的探索从来没有停息过，致使五花八门的治疗方法层出不穷，令人目不暇接、甚至上当受骗。

“骗子横行”似乎成立孤独症领域的默认思维模式。当听到或看到有人想告诉你治疗方案时，苦于缺乏鉴别力，统统视为骗子的确是个很不错的策略。

孤独症之音，本公众号就是为了提升“鉴别真/假、有效/无效治疗孤独症手段的能力“而建设的。推出的文章所涉及的内容，皆来自一流杂志期刊、名家书籍，以及基于这些素材的思考。

在研究孤独症及治疗时，我们并不会把自己局限于孤独症领域，甚至是那些可怜的过时的机制。我们涉及广泛的神经科学以及神经精神病学相关领域，当然也必须追踪基因和干细胞疗法此类的终极工具的研发进展，顺便也追踪脑-肠轴与孤独症的相关性，因为我们具有这种能力！

令人鼓舞的是，像CRISPR/Cas9这样的基因编辑工具已经证明了，在老鼠和其它动物模型中是可以做到逆转复杂的大脑疾病，但目前还没有在人类中逆转成功。

上个月看到了一篇使用cDNA基因递送直接靶向修复了受损的人类中脑多巴胺能神经元功能的文章，甚是鼓舞，因为这与孤独症治疗有着直接的密切相关性。特此分享交流。

我们是在解决了自身需要思考的问题时，与需要的人分享和切磋而已。如果扰动了你的神经系统，令你不爽，请你忽视我们的存在。

我们总是要确认某些东西的，尤其在面对孤独症时，我们只想力求治疗效果的最大化——时间不等人！无论是真的、还是上当受骗的，这个都得依靠自己的判断力，没有人会有能力帮到你，因为哪怕是真的在你面前，你也得有能力去认识它。

我们不割韭菜，弯腰太累。我们也不故弄玄虚，太费脑。诺贝尔奖金，那是肯定想的，但人家也没有可能给啊！

如果你已经上了我们的当，请先不要诅咒我们，我们肯定不是故意为之的。这是我们的学业不精、专业不过关造成的，我们愿意根据相关的法律、或者行政法规予以赔偿。

如果你只是看了文字，即刻觉得上当、不爽、恶心，那也请你原谅我们的无心冒犯，这是我们想通过推文探寻志同道合者时的副作用，在此向你表示对不起。

照护孤独症孩子是一件旁人无法想象的极累的事。随着孩子的年龄增加，能力没有进步、情绪还越发严重，照护者的精力也越来越差，并且孩子的未来还没落停，将会更累。为此，我们只能深度学习和深度研究，以免把无知当科学而误事。再者，从广义上讲，所谓的科学也不是绝对统一的，唯一绝对的就是不确定性。聊得来就聊，聊不来就散，我们各自安好吧！

秉承傍全球一线杂志期刊的原则，我们会继续推送发人思考并且有助于孤独症孩子进步的文章。___RAY

引子

中脑VTA和SNc的多巴胺能神经元以及它们的投射广泛地致命地影响着大脑功能，几乎与主要的神经精神病理状态都有紧密的关联。证据表明，它们在孤独症中是受损，严重制约了孤独症个体的思维、认知灵活性以及目标导向行为——所谓的社交功能是建立在此类认知功能基础上的。

不解决思维、认知灵活性以及目标导向行为功能的缺失，无法讨论改善社交功能。而思维、认知灵活性以及目标导向行为功能是建立在神经回路、神经网络基础上的。所以，我们聚焦于神经回路、神经网络的修剪。虽然你看不见，可能也想象不出来，但是它们的确是存在的，它们支配了你的一言一行。

(Frontalcortex,Nucleusaccumbens,VTA)，是皮层－纹状体－中脑的螺旋状多巴胺能结构的主要部件是人类行动和行为的驱动引擎，包括(强化)学习行为。

如果把此人类行动和行为的驱动引擎比作汽车引擎的话，这个螺旋状多巴胺能结构中的伏隔核负责“点火”，好比是火花塞；多巴胺，就好比是汽油，而VTA是炼油厂，自产自销油料——多巴胺。研究发现：孤独症造成了动机回路中的“点火”装置——伏隔核活性降低或VTA-伏隔核通路(油路)阻塞，导致了皮层-纹状体-中脑螺旋状多巴胺能结构异常，孤独症个体的动机受损——强化学习机制受损。

(Sriatum,Substantianigra)，也是皮层－纹状体－中脑的螺旋状多巴胺能结构的主要部件，其中SNc(Substantianigraparscompacta)是炼油厂，也负责自产自销多巴胺。它们的受损与孤独症的RRBIs成正相关性。

(Hippocampus)，是海马，其记忆功能也与多巴胺密切相关。上个月在PNAS(美国国家科学院院刊)上，MaríaCarolinaGonzalez和同事们测试了海马多巴胺D1/D5受体是否通过重新巩固来控制新记忆与旧记忆的联系，还是作为独立的痕迹巩固。结果表明，多巴胺将回忆过程中的新奇检测与陈述性记忆的不稳定结合起来，并决定一个新的痕迹是否会与一个活跃的网络相连接，最终决定其未来对间接再激活的敏感性。

这项由加州大学旧金山分校和俄亥俄州立大学开创的研究，使用cDNA基因递送直接靶向修复了这2个炼油厂受损的自产自销多巴胺的功能，令人赞叹、鼓舞。

基因疗法的策略

基因治疗的目的是通过纠正异常的基因表达来缓解疾病症状，最终治愈疾病。这可以通过引入表达外源基因或抑制内源性基因表达水平的遗传物质来修饰基因表达水平。基因治疗也可以设计成直接编辑患者体内的基因突变。在过去的几年里，新型基因编辑工具的发展提高了基因递送到大脑的功效。随着这一令人兴奋的技术进步，基因疗法作为一种潜在的神经发育和神经退行性疾病的治疗策略，最近受到了越来越多的关注，特别是对于那些由基因突变引起的扰乱身体通常的基因表达模式的疾病。

有几种设计基因治疗的方法来纠正神经系统疾病中的异常基因表达。

其中之一是表达外源性蛋白，以恢复内源性蛋白的功能。因此，腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是首选的病毒载体，因为其相对安全，且基因长期表达，减少了重复给药的需要。在被引入细胞后，AAVs可以通过宿主细胞的转录和翻译机制表达它们携带的基因。通过这种方式，AAVs产生的蛋白质可以弥补基因功能的缺失。病毒工程领域继续完善AAVs的结构，以提高其安全性和递送到中枢神经系统的有效性。这项由加州大学旧金山分校和俄亥俄州立大学开创的研究，使用cDNA基因递送直接靶向修复了中脑多巴胺能神经元的功能，就是使用这种策略。

DNA编辑技术可以直接修复致病突变，改变基因表达水平，是一种极具吸引力的基因治疗疗法。DNA编辑工具的最新进展涉及合成CRISPR系统(“成簇的规则间隔短回文重复序列”的缩写)，其中定制的引导RNA可以将DNA切割酶(例如Cas9)带到感兴趣的基因的特定位点。一旦酶从基因中切掉一些碱基对，基因序列最终将发生改变，并产生一个过早终止密码子。细胞机制以这个停止密码子为标志，降解该基因转录的信使RNA，最终沉默靶基因的表达。这种基因工具在治疗神经系统疾病方面具有巨大的潜力，因为它可以用来灭活或激活感兴趣的基因，或编辑基因内的精确碱基和纠正致病基因突变。

除了DNA编辑工具，利用反义寡核苷酸(ASOs)的RNA疗法也因其潜在的疗效而备受关注。ASOs是短的DNA或RNA片段，可以结合信使RNA基于互补序列，进而改变RNA表达水平。因此，ASOs可以被合成为疾病基因转录的靶信使RNA，以期能够调节在神经系统疾病中可能发挥关键作用的蛋白质水平。

尽管有这些挑战，提高我们利用基因疗法有效治疗神经系统疾病能力的生物医学技术会不断发展。例如，过去将AAVs输送到中枢神经系统曾经是一项极具挑战性的工作，因为将AAVs直接注入大脑是不可行的，但是由加州大学旧金山分校和俄亥俄州立大学开创的研究改变了这一现状。

至此，我们可以一起欣赏这一科技成果了！

文献摘要

芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏症是一种罕见的遗传性疾病，其特征是多巴胺和血清素合成不足。它出现在婴儿期，并导致严重的发育障碍和终身的运动、行为和自主症状，包括动眼神经危象(OGC)、睡眠障碍和情绪障碍。作者证实了将表达AADC(AAV2-hAADC)的病毒载体递送至AADC缺陷儿童中脑的安全性和有效性(ClinicalTrials.gov标识符NCT02852213）。

7名4-9岁的儿童接受了对双侧黑质(SN)和腹侧被盖区(VTA)的AAV2-hAADC对流增强递送(CED)(总输注量：每半球80µL)在2剂量队列：1.3×1011vg(n = 3)，和4.2×1011vg(n = 4)。主要目的是证明该方法的安全性，并记录脑AADC活性恢复的生物标志物证据。次要目的是评估临床症状和运动功能的改善。双侧直接输注AAV2-hAADC是安全的，耐受性良好，并分别实现了98%和70%的SN和VTA的目标覆盖率。所有受试者多巴胺代谢均增加，中脑和纹状体内FDOPA(6-[18F]-氟-L-多巴)摄取增强。

术后3个月，7名受试者中有6名OGC完全消退。术后12个月，6/7的受试者获得了正常的头部控制能力，4/7的受试者可以独立坐立。18个月时，2名受试者可在双手支撑下行走。研究的主要终点和次要终点都达到了。在AADC缺陷儿童中脑基因递送是可行和安全的，并导致临床症状和运动功能的改善。

里程碑式的基因治疗

芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)缺乏是一种罕见的遗传疾病，导致大脑化学物质血清素和多巴胺水平几乎缺失。这些神经递质对运动、行为和睡眠至关重要。AADC缺陷在婴儿期出现，并导致严重的发育障碍、影响行走和说话的运动问题、情绪问题和睡眠障碍。

AADC缺乏的儿童在幼年时就有因疾病并发症而死亡的风险。目前还没有有效的治疗方法。增加多巴胺水平的药物治疗收效甚微。

DDC基因突变导致AADC缺陷。此前在台湾和日本进行了基因治疗以替代该基因的试验，结果好坏参半。

这项试验包括7名4至9岁的儿童，他们生来就缺乏AADC。AADC是一种参与神经递质合成的酶，尤其是多巴胺，导致他们无法说话、进食或抬起头。其中6名儿童在加州大学旧金山分校接受治疗，1名在俄亥俄州韦克斯纳医疗中心接受治疗。

在这项研究中，儿童的运动功能得到改善，情绪改善，睡眠时间延长，与父母和兄弟姐妹的互动更加充分。除了一名患者外，所有患者的动眼神经危象均已停止，这是该疾病的一个特征，包括不自主地向上凝视，可能持续数小时，并可能伴有癫痫样发作。2021年7月12日，研究结果发表在《NatureCommunications》杂志上(点击文章底端——阅读原文)。

据了解，全世界只有135名儿童缺失AADC酶，而这种情况影响了更多的亚裔人。

这项试验借鉴了用于治疗帕金森氏症的基因递送技术，该技术由加州大学旧金山分校神经外科系、威尔神经科学研究所和俄亥俄州立大学神经外科系的资深作者KrystofBankiewicz医学博士率先提出。

多巴胺在血液中只能维持一到两分钟。因此，帕金森氏症患者只能用它的代谢前体左旋多巴来治疗，这种药物也更容易制造，而且可以口服。一旦进入大脑，左旋多巴就会被AADC酶分解成多巴胺。Bankiewicz的帕金森基因疗法是为了帮助剩余的神经元更有效地将治疗转化为可用的神经递质形式。

这两种情况都与AADC缺陷有关，AADC可将左旋多巴转化为多巴胺，多巴胺是一种与运动、情绪、学习和注意力有关的神经递质。

AADC缺乏的患者有不同的问题。他们的神经元并没有死亡。它们结构完整，也能产生左旋多巴。但随后他们遇到了障碍。因为它们的AADC基因被破坏了，它们就不能产生执行关键的最后一步将其转化为多巴胺的酶。没有多巴胺，神经元虽然各自健康，却不能相互交流。

Pearson和Bankiewicz认为，如果他们能够将AADC基因的健康拷贝传送到产生多巴胺的神经元聚集的中脑部分，他们就可以利用所有完整的回路。一旦进入神经元，这种特殊的病毒就会沿着每个轴突移动，通常会延伸到不同的大脑区域，直到到达产生多巴胺的突触。

AADC还负责血清素生成的最后一步，但这些神经元位于脑干(中缝核)更难到达的部分。因此，研究人员决定只针对产生多巴胺的细胞。

他们向美国国家神经疾病和中风研究所(NINDS)申请了资金，并获得了大约300万美元的资金，用于生产病毒载体，并在开始临床试验之前进行毒理学研究。2017年，他们开始给第一批患者注射药物。由于需要使用成像技术来引导基因治疗深入大脑，他们只接受年龄在4岁以上的患者，这些患者的头骨已经形成，足以安全地承受手术所需的核磁共振头部支架。

在这项研究中，Bankiewicz博士和他的同事们给7名儿童注射了DDC基因，该基因被包装在腺病毒中。该载体通过颅骨上的一个小孔注入大脑，利用实时磁共振成像使神经外科医生能够绘制目标区域，并计划插管和输注，然后被输送到脑细胞中。DDC基因被整合到细胞的DNA中，并为细胞制造AADC提供指令，AADC是产生血清素和多巴胺所必需的酶。研究小组利用磁共振成像技术，将基因疗法精确地植入中脑的两个特定区域。

圣路易斯华盛顿大学医学院的儿科神经学家、这项新研究的主要作者ToniPearson说。“我们仍然认为，越早实现这一目标，受益的潜力就越大。但我认为，我们正在发现什么是可塑性的窗口，仍然在取得进展。”

“原发性AADC缺陷的儿童缺乏该基因的功能拷贝，但我们假设他们实际的神经元通路是完整的，”另一主要作者加州大学旧金山分校神经外科系的NalinGupta说。“这与帕金森氏症不同，后者产生多巴胺的神经元会发生退化。”

帕金森氏症的研究重点是壳核，这是大脑中在这种退化中起关键作用的部分，Gupta说AADC基因治疗试验针对的是黑质和脑干腹侧被盖区的神经元，这些部位可能有更多的治疗益处。

Bankiewicz说：“治疗AADC缺陷的方法比治疗帕金森要直接得多。”“在AADC缺乏的情况下，大脑的线路是正常的，只是神经元不知道如何产生多巴胺，因为它们缺乏AADC。”

跟踪AADC缺乏症患者的医生一致认为，通过控制症状来治疗AADC通常效果有限，比如帕金森病的药物增加多巴胺，褪黑素治疗睡眠障碍，苯二氮卓类药物缓解动眼神经危象。

手术后3个月和24个月进行的正电子发射断层扫描(PET)显示大脑AADC活性增加，从脑脊液中筛选的神经递质代谢物在基因递送后显示浓度升高。基因治疗导致了与运动控制有关的大脑深部结构产生多巴胺，脊髓液中多巴胺代谢物水平显著升高。

理想的收获

在研究开始时，七个孩子中只有两个能部分控制头部，只有一个能伸手或抓东西，没有一个能独立坐着。7人中有6人被描述为易怒，除一人外，其余都患有失眠症。他们的基本运动技能得分都在严重损害范围内。

治疗后临床症状有所改善。7名患者中有6人的动眼神经危象完全消失，这种危象是眼球异常向上运动，通常伴有头部、颈部和身体的不自主运动，可持续数小时，是该疾病的标志。在一些儿童中，治疗后9天就可以看到改善。一名参与者继续经历动眼神经危象，但他们不那么频繁和严重。

所有患者在运动功能方面都有明显的改善，表现为增强的张力和更好的头部和躯干控制以及有目的的肢体运动。到第12个月，7个孩子中有6个已经能够控制头部，4个此时已经能够独立坐了。此外，在12个月时，3名患者能够伸手和抓握，2名患者能够在躯干支撑下行走。手术后两年半，一名患者开始采取独立的走步。一名患者在12个月后能够使用大约50个单词的词汇说话，另一名患者在基因递送后的12到18个月之间能够使用辅助设备进行交流。

据报道，父母和护理人员对孩子在睡眠和情绪以及进食困难(如呕吐和由于大量粘液分泌和堵塞造成的上呼吸道阻塞)方面都报告有显著改善。手术的耐受性良好，没有不良的短期或长期影响，但一名儿童在手术后7个月死亡。研究人员表示，患者健康状况良好，死亡原因“很可能是由潜在的原发疾病引起的”。

这项研究是在帕金森试验之后进行的，该试验也显示出了积极的结果，控制良好的症状持续时间延长了。Bankiewicz团队将启动两项新的基因治疗试验，使用相同的外科技术和病毒载体，用于早期阿尔茨海默病和多发性系统萎缩(一种罕见的神经退行性疾病)。两项试验都将在俄亥俄州立大学进行，并将于下个月开始。

“值得注意的是，这些症状是基因治疗手术后第一个消失的症状，而且再也不会复发，”Bankiewicz博士说。在接下来的几个月里，许多患者都经历了改变生活的改善。他们不仅会笑，心情也会变好，很多人还会说话，甚至会走路。他们正在弥补非正常发育过程中失去的时间。”

“实际上，我们正在做的是给细胞引入一种不同的代码，”俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心(OhioStateWexnerMedicalCenter)神经学研究所神经外科肿瘤学主任James“Brad”Elder博士说。“我们正在现场观看整个过程。因此，我们不断重复核磁共振成像，我们可以看到输注在所需的核内开花。”

研究人员认为，同样的基因治疗方法可以用于治疗其它遗传疾病以及常见的神经退行性疾病，如帕金森氏症和阿尔茨海默病。临床试验正在进行中，以测试其它患有衰弱和无法治愈的神经疾病的人的这一程序。

在这些患者中，靶向基因治疗导致了症状、运动功能和生活质量的显著改善。这种治疗方式有望在未来改变AADC缺陷和其它类似大脑疾病的治疗。

这项研究中描述的发现是多个学术机构团队数十年工作的成果，包括加州大学旧金山分校、华盛顿大学圣路易斯分校、亚特兰大医学神经遗传学实验室、圣路易斯儿童医院和俄亥俄州哥伦布市全国儿童医院。

这项研究得到了美国国家神经疾病和中风研究所(NINDS)的支持，并得到了包括AADC研究信托基金、儿科神经递质疾病协会和俄亥俄州立大学的资助。

“这项工作为治疗其它人类神经系统遗传疾病提供了一个框架。Bankiewicz说：“我们希望，这将是许多极其罕见和其它神经疾病的第一例，这些疾病将以类似的方式用基因疗法治疗。”

本研究由NINDS资助(R01NS094292,NS073514-01)。向作者等人提供大约300万美元的资金，用于生产病毒载体，并在开始临床试验之前进行毒理学研究。NINDS是美国大脑和神经系统研究的主要资助者。NINDS的使命是寻求关于大脑和神经系统的基础知识，并利用这些知识来减少神经疾病的负担。