PCR-DGGE技术分析孤独症家庭成员肠道菌群结构

张仁敏1,周东蕊1,＊,宋　媛3,杜彩贺1,魏婷婷1,胡　芳2,陆祖宏1,2

(1.东南大学学习科学研究中心,江苏南京210096; 2.东南大学生物电子学国家重点实验室,江苏南京210096;3.苏州市立医院儿童保健科,江苏苏州215002)

摘　要:目的应用PCR-DGGE(denaturinggradientgelelectrophoresis,变性梯度凝胶电泳)技术对孤独症家庭成员肠道微生物菌群结构进行研究.材料和方法提取粪便细菌总基因组DNA,PCR扩增细菌16SrDNA基因V 3可变区,DGGE方法检测PCR产物.结果建立了孤独症家庭成员肠道菌群组成的DGGE指纹图谱,分析结果显示孤独症儿童肠道菌群结构的相似度为0.42- 0.65,家庭内孤独症儿童与父母之间的相似度为0.42- 0.68.结论PCR-DGGE技术是一种快速有效的用于分析研究人体肠道菌群结构的技术.孤独症儿童肠道菌群结构与父母的相似度较高,提示生活环境对肠道菌群的组成有影响.

关键词:PCR-DGGE;孤独症;肠道菌群;16SrDNA

中图分类号:R 749.93　　文献标识码:A　　文章编号:1009-7902(2010)06-0066-04

　孤独症(autism spectrum disorders,ASD)是儿童时期广泛性发育障碍中最为典型和常见的一种疾病,以严重孤独、缺乏情感反应、语言发育障碍、刻板重复动作和对环境奇特的反应为特征.孤独症一般在3岁前发病.该病的患病率较高,而且近年呈明显的上升趋势.在过去20年里,孤独症患者诊出率提高到原来10倍多[1-3].孤独症是一类由多因素导致的综合征,基因等遗传因素的病因已经得到证实[4,5].多项研究发现孤独症儿童多数具有便秘或腹泻,有时交替出现、胃肠道产生大量的异常气体、打嗝、大便异味、腹痛和腹部不适等.研究发现,孤独症患者中多数人有经常服用抗生素的历史[6],有人采用万古霉素对孤独症患者进行治疗,发现服用万古霉素等一些抗生素之后,症状确实有明显的改善[7].口服抗生素容易打乱肠道微生物的保护作用,可能为致病菌提供一个好的生存环境.Bolte(1998)[6]报导肠道梭菌属细菌(也可能是其他类型的细菌)可能是引起迟发性儿童孤独症的重要原因.Syd-ney(2008)[8]提出多个孤独症病例发生在同一个家庭中可能与梭菌属细菌产生孢子有关系,因为这些孢子很难用抗生素等从体内或环境中彻底清除.因此胃肠道微生物组成紊乱可能与孤独症的发生有一定关系.肠道微生物群落的分析方法主要有沿用已久的传统培养法和近年来兴起的基于基因序列的微生物分子生态学方法,而后者成为越来越重要的研究方法.基于16SrRNA[9]序列的DGGE(denaturedgradi-entgelelectrophoresis,变性梯度凝胶电泳)技术已成为最近国内外研究微生物分子生态的重要技术,被广泛运用于分析临床或环境样品细菌群落结构的研究中[10,11].本研究选取了7个孤独症家庭成员共16份粪便样本,PCR扩增16SrRNA基因的V 3区,产物进行变性梯度凝胶电泳分析,以探讨孤独症家庭内成员之间粪便样本中的菌群组成情况.

1　材料与方法

1.1　材料

所用16份粪便样本(7个孤独症家庭)于2009年5月采自苏州市立医院,孤独症儿童年龄为2～ 9岁,采集后立即- 70℃冻存.

1.2　方法

1.2.1　粪样细菌总DNA的提取提取方法参照文献[12]进行,将得到的总细菌DNA溶于100ul无菌水中,用NanoDropND 21000核酸浓度测定仪测定总DNA浓度,置- 20℃保存备用.

1.2.2　粪样细菌16SrRNA V 3区的PCR扩增利用P2、P3引物进行16SrRNA V 3区的扩增,引物序列参照文献[13]设计并合成.引物序列:P2:5'-ATTACCGCG GCTGCTGG- 3',P3: 5'-CGCCCG CCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGG GGG GCCTACGGG AGG CAG CAG- 3'(引物5'端粗体部分为40bp“GC夹”),产物长度230bp左右.25ul体系中含有0.5uldNTP,2.5ul 10×Buffer(Mg2+ free), 2. 5ulMgCl2,每种引物1um,0.25∪ Tag酶.PCR反应采用两步法:第一步为“TouchdownPCR”[13],反应程序为:94℃预变性4min; 94℃ ,1min;65℃ ,1min;72℃ 1min为一个循环,每循环2次退火温度下降1℃ ,直到退火温度为55℃ ,再以55℃为退火温度循环4次,最后是72℃延伸10min.第二步采用“ReconditioningPCR”[13],反应程序为:94℃预变性4min;接着94℃ ,1min;55℃ ,1min;72℃ 1min共循环6次,最后72℃延伸10min.PCR产物的长度采用1.5%琼脂糖电泳检测.

1.2. 3　DGGE分析并对其图谱进行相似性比较

采用DCodeDGGE系统(Bio-Rad)进行上述PCR产物的DGGE.丙烯酰胺凝胶浓度为8%,垂直电泳变性梯度为0%～ 80%(100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺),平行电泳变性梯度为22%～ 58%(100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺),PCR产物的上样量为每个泳道约8ul.使用1×TAE缓冲液在200V、60℃条件下预电泳5min,然后再180V、60℃条件下电泳3h.电泳后凝胶使用GelRed进行染色.最后使用Bio-Rad凝胶成像系统进行拍照,其图谱采用UPGMA聚类构建系统树进行相似性分析.

2　结果

2.1　V 3区16SrRNA PCR扩增结果图1显示所有样本都成功扩增出菌群16SrD-NA V 3区产物,产物长度230bp左右.

2.2　DGGE图谱

图2显示了用于分离样本的垂直DGGE电泳图,结果显示用于分离样本的平行DGGE最佳的分离条件是垂直DGGE图S型图谱的的最大斜率之间的梯度,即变性梯度为22%～ 58%(100%变性剂为7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺).

2.3　DGGE图谱分析

图3-A显示7个孤独症家庭成员(16个样本)肠道菌群DGGE指纹图谱,每一条泳道代表1个成员肠道菌群DGGE指纹图谱.灰度反映细菌相对量的多少,图3-A可以看出不同泳道的条带位置、数量和灰度有明显的差异,16个样本中无共同条带,说明16个个体粪样菌群结构存在明显个体特异性,反映了肠道细菌的结构存在明显的多样性差异,同时也呈现不同的优势菌条带.图中还可看出,7个孤独症儿童粪样菌群存在共同条带e;每个家庭内孤独症儿童与其父母存在特征性的共有条带,如1号家庭中的儿童与其父母有5个共有条带(a-e),共有条带数最多,6号家庭只有共有条带a.DGGE图谱相似性分析(图3-B)显示,所有样本的肠道菌群相似度为0.36- 0.71,孤独症儿童肠道菌群图谱相似度能达到0.42,最高能达到0.65;而家庭内孤独症儿童与其父母之间相似度较高,最高能达到0.68.图3　A:7个孤独症家庭成员(16个样本)肠道菌群DGGE图谱;B:DGGE图谱相似性分析

3　讨论

人体肠道中栖息着种类繁多和数量巨大的微生物,包括真菌、细菌和古细菌,这些微生物与人体相互依存,构成了肠道的微生态系统,对促进食物消化、产生维生素等营养物质、抵御外来致病菌侵入、刺激免疫系统等方面有着重要作用.正常情况下,这些微生物对机体无害,或有利于机体的健康.微生物学研究表明,环境条件的轻微变化,均可导致机体微生态系统的变化,造成菌群的失调,对宿主的肠道功能产生不良影响.一旦肠道菌群发生紊乱,肠道微生态破坏,可能会引起内外源性感染,干扰机体营养代谢和免疫功能,甚至严重影响机体健康,导致一系列疾病的发生.所以对人体肠道这个微生态的研究意义重大.DGGE技术是由Muzyer等[13] 1993年首次将该技术应用于分子微生物学研究领域.它主要是利用梯度变性胶来分离DNA片段.DGGE具有传统微生物分析方法无可比拟的优势,在实验室得到广泛的应用.在临床诊断上也有利用16S rDNA PCR -DGGE方法的研究报道[14,15].已有多篇研究报道肠道菌群结构的组成与遗传、环境等有关[16].本研究中,16SrRNA V 3区的PCR -DGGE图谱能够对人体肠道主要菌群组成进行区分.本研究中的16份粪便标本的DGGE图谱显示高度的多态性,而且不同标本间的带型均存在很大的差异.DGGE图谱及其相似性分析显示家庭内孤独症儿童与其父母间具有较高的相似性.提示生活环境对肠道菌群的组成有影响.由于肠道菌群与饮食、年龄、个体基因以及生活环境等[17]有关,所以每个个体肠道菌群结构是不一样的.本研究分析所用样本量太少,为了更确切的了解孤独症肠道菌群组成与环境之间的关系,我们需要增大样本量进行分析,包括与孤独症小孩经常接触相同生活环境的成员纳入分析中;而且同一个体粪便性状不同时,菌群组成也会不同,本研究没有把粪便性状列入分析中,因此为了更好的分析孤独症肠道菌群组成与环境之间的关系,我们在采集样本时需考虑粪便样本性状.虽然DGGE能区分开这些菌群但并不能确认这些条带所代表的细菌.这些细菌的分类地位必须采用割胶回收、克隆后用DGGE确认再测序的方法才能确定.因为本研究主要是研究这些肠道菌群的多样性的比较,所以没有对单个条带所代表的细菌进行进一步研究.

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