自闭症患者治疗前后肠道微生物菌群分布多样性研究 *

邹俊1，曾令兵2，蔡沁明3，王星星3，钟霞1，胡妮娅2

(1.江西省儿童医院，南昌 330006；2.南昌大学第一附属医院检验科，南昌 330006；3.南昌大学医学院，南昌 330006)

摘要：目的 通过 16s r RNA 测序技术比较分析自闭症组治疗前和治疗后及与健康儿童肠道微生物菌群分布的差异，以期寻找与自闭症发生发展相关的特异菌群。 方法 根据设定的入选标准分别收集自闭症患者治疗前（R 组）、治疗后（C 组）及健康对照儿童（Z 组）粪便标本各 20 例，然后进行粪便基因组 DNA 的提取与 16s r RNA 测序，并对测序结果进行统计学分析及生物信息学分析。 结果 通过对 60 例样本的菌群分布多样性分析，得知在门水平硬壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门在各个组均占绝大多数，其中硬壁菌门在各个组丰度均最高；属水平 Escherichia-Shigella、[Eubacterium] coprostanoligenesgroup R 组 比 C 组 丰 度 高 ，克雷伯 氏 菌 （Klebsiella）只 存 在于 R 组 和 C 组 中 ，且 C 组 比 R 组 丰 度 低 。 由 此 可 见 ，自 闭 症 患者 肠道微生物群中志贺菌属、克雷伯菌属和韦荣球菌属丰度明显增高，其中志贺菌属变化最显著。 结论 自闭症患者与健康人群肠道微生物菌群的分布确实存在一定差异，且自闭症患者治疗前后肠道微生物菌群也存在一定的改变，这与自闭症的发生发展有一定的相关性。

关键词：自闭症；微生物菌群；16s r RNA 测序

中图分类号：R749.94 文献标识码：B 文章编号：1006-2238(2019)10-1157-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-2238.2019.10.004

Diversity of intestinal microflora distribution in patients with autism before and after treatment* ZOU Jun1,ZENG Ling-bing2,CAI Yuming3,et al. 1. Jiangxi Children's Hospital, Nanchang 330006, China; 2.Department of Clinical Laboratory, theFirst Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China; 3.Nanchang University School of Medicine, Nanchang330006, China.

Abstract：Objective To compare the distribution of gut microbiota between pre -treatment and post -treatment and healthychildren in the autism group by 16s r RNA sequencing technology, to find specific microflora related to the development of autism.Methods Autistic specimens were collected from pre-treatment (R group), post-treatment (C group) and healthy control children(Z group) fecal specimens according to the selected inclusion criteria, and then fecal genomic DNA extraction and 16s r RNA wereperformed. Sequencing and statistical analysis and bioinformatics analysis of the sequencing results. Results Through the analysisof the distribution of the flora distribution of 60 samples, it was found that the hard -shelled bacteria, actinomycetes, Bacteroidesand Proteobacteria in the horizontal group accounted for the majority in each group, among which the hard wall bacteria Theabundance was highest in each group; the level of Escherichia-Shigella, [Eubacterium] coprostanoligenes group R was higher thanthat of group C, and Klebsiella was only present in group R and C, and group C was higher than The R group has a low abun-dance. It can be seen that the abundance of Shigella, Klebsiella and Vesococcus is significantly increased in the gut microbiota ofautistic patients, and the Shigella genus changes most significantly. Conclusion This study shows that there is a certain differencein the distribution of intestinal microflora between autistic and healthy people, and there is a certain change in intestinal microflorabefore and after treatment in autistic patients, which is related to the development of autism. There is a certain correlation.

Key words: Autism; Microbial flora; 16s r RNA sequencing

自闭症谱系障碍(ASD)是一种发育性神经行为障碍，其特征是行为受限、重复、社会交往和沟通障碍[1,2]。 其中，孤独症是 ASD 的主要类型[3,4]。 自闭症已经成为儿童精神类致残的重要疾病， 随着发病率的升高，自闭症给患者家人造成了巨大的精神压力与经济负担， 同时也对社会造成了不利的影响。导致自闭症的因素有很多，其中包括环境因素、家庭因素、代谢因素、遗传因素、免疫系统异常[5]、脑器质性损害等， 以及各个因素之间的相互作用。但是到目前为止，人们对自闭症的致病机制尚未完全阐明。表 2 入组研究对象情况表患者组 健康对照组总研究对象男/女年龄（年）治疗持续时间2018/23.49±1.262.572018/24.56±1.15近几年，有学者提出了“脑-肠-微生物轴”这一说法[6]，他 们 认 为 ：肠 道 里 的 神 经 细 胞 不 论 在 类型、 神经递质还是在感受器方面都和大脑中的神经细胞非常相似， 并且和大脑的神经细胞数量不相上下,细胞数量甚至比脊髓中的还多 。 因此，肠道有时被称为人的“第二脑”或“肠脑”[7]，肠道能够通过多个途径影响中枢神经系统, 进而影响人的情感、认知和行为[8]。 肠道微生物群参与了免疫系统的成熟，还可通过迷走神经、神经递质等途径导致神经精神障碍。 过去人们对肠道微生物的研究方法主要依赖分离培养技术， 但肠道内可以培养的细菌很少，只占了肠道细菌总数的一小部分，肠道内大部分的微生物是很难人工培养的。 近几年，随着分子生物学技术的发展进步， 一种快捷且灵敏的对病原微生物的检测方法 16S r RNA 基因序列分析技术的诞生， 不仅解决了研究过程长而且繁琐、细菌难以培养，而且解决了很容易受到药物干扰等诸多问题[9,10]。 本研究共收集自闭症患者治疗前（R 组）、治疗后（C 组）及健康对照儿童（Z 组）粪便标本各 20 例， 通过 16s r RNA 测序技术及生物信息学分析比较各个组肠道微生物菌群分布的差异。

1 资料与方法

1.1 研究 对 象 本 研究 分 为两个 组 ， 自 闭 症 组 20例为某医院住院治疗病人并符合美国精神疾病诊断与统计手册第五版 DSM-Ⅴ自闭症诊断标准，基于社会沟通与社会互动的缺陷和限制性的重复性行为、兴趣与活动，将严重级别按照可支持性程度又可分为一、二、三级。 自闭症组收集患者治疗前的粪便标本 (R 组)，以及经过一段时间的治疗评价其严重程度得到明显缓解的粪便标本（C 组）；健康对照组 20 例来自南昌大学第一附属医院及省儿童医院健康体检人群， 并经过简明国际神经精神障碍访谈检查排除精神疾病（Z 组）。 同时，自闭症组和健康对照组的入选标准需符合表 1，2。

1.2 标本处理

1.2.1 粪便 标 本 采 集 及 预处理 

粪便 标 本 采 集 ：采集经过筛选并知情同意的受试者的新鲜粪便，立即放入冰盒中，转运到实验室进行预处理。 分装处理：将标本按照入组先后顺序编号，每个样本精确称取 200mg， 并放入新的无菌的 2ml 离心管中，每

个样本准备 3 份，两份用于基因组 DNA 的提取与随后的测序工作，剩余 1 份保存备用。 所有的过程均需在粪便采集后 15min 内处理完毕， 并随即保存在-80℃冰箱中以方便后期使用。

1.2.2 粪便 基 因 组 DNA 的 提 取 及测 序 

按照 试 剂盒提供的试验步骤提取基因组 DNA， 并用核酸定量 仪 Nano Drop ND -1000 (Thermo ElectronCoiporation)定量，观察抽提率情况。 然后用 2%的琼脂糖凝胶电泳检测细菌基因组的大小和完整性。利用部分提取的基因组以 16S r DNA 基因 V3 可变区作为目的基因进行 PCR 扩增并送测序，剩余的抽提得到的细菌基因组 DNA 均保存于-20°C冰箱备用。

1.3 数据 分析 将 测 序 得到 的 原 始 数据 根 据 要 求

筛选出质量较高的有效序列，生成 OTU（可操作的分类学单位）。 筛选标准如下：⑴序列至少含有一段完整的 Barcode 和引物；⑵除去 Barcode，引物，接头，序列长度必须大于 150bp；⑶不含有模糊碱基；⑷不能存在超过 6 个的单碱基重复。1.4 统计方 法 应 用 SPSS19.0 统计 学 软件 进行 数据 分 析 ， 两 两 比 较 采 用 Student's t -test 和Wilcoxon's sign rank test 检验 ，以 P<0.05 为 差异 具表 1 自闭症组和健康对照组入选标准自闭症患者组入选标准严格诊断为自闭症谱系障碍年龄：1-8 岁无其他全身性疾病理解研究内容并签署知情同意书能配合完成问卷健康对照组入选标准年龄、性别、社会经济状况与自闭症儿童相当精神健康、肠胃健康无全身性疾病理解研究内容并签署知情同意书能配合完成问卷剔除标准送检粪便样本不合格数据不完整排除标准在研究前 3 个月服用抗生素2 周内 进行 过 局 部 抗菌 治疗高蛋白饮食或使用了益生菌肠胃问题，如慢性腹泻、便秘等排除标准肠胃问题，如慢性腹泻、便秘等注意力缺陷疾病与自闭症患者相关的人（兄弟、姐

妹、叔叔或阿姨）2 周内 进行 过 局 部 抗菌 治疗有统计学意义。

2 结果

2.1 Miseq 测 序序列 结 果 

分析 Miseq 测 序 得到 的PE reads 首先根据 overlap 关系 进行 拼 接 ， 同时 对序 列 质 量 进 行 质 控 和 过 滤 ，60 个 样 本 共 获 得2875159 条高质量序列。 每个样本的平均优化序列数 为 68456 条 ，R 组 获 得 的 平 均 优 化 序 列 数 为

79113 条 ，C 组 获 得 的 平 均 优 化 序 列 数 为 70149条，Z 组获得的平均优化序列数为 67110 条。

2.2 OTU 聚类 

通过归类操作，将序列 按照 彼 此 的相似性分为许多小组，一个小组就是一个 OTU。 可根据不同的相似度水平，对所有序列进行 OTU 划分，去除没有重复的单序列，通常在 97%的相似水平下的 OTU 进行聚类， 在聚类过程中去除嵌合体，得到 OTU 的代表序列。 将所有优化序列 map至 OTU 代表序列， 选出与 OTU 代表序列相似性在 97%以上的序列，生成 OTU 表格。 根据该原则生成本研究的 OTU 表格如下：

2.3 多样 性 指 数 分析 （Alpha-diversity） 群 落 生 态

学中研究微生物多样性， 通过单样本的多样性分析（Alpha 多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性， 包括一系列统计学分析指数估计环境群落 的 物 种 丰 度 和 多 样 性 。 计 算 菌 群 丰 度（Community richness） 的指数有： Chao 和 Ace ；计算菌群多样性 （Community diversity） 的指数有：Shannon 和 Simpson；测序深度指数有：Coverage。 两两比较结果如下。菌群多样性指数(Shannon 和 Simpson)分析中，ZC 和 ZR 比较均 P<0.05，具有统计学意义。

2.4 稀释曲线（Rarefaction curve） 

稀释曲线[11]是在一个标本测序之后得到的所有序列中抽取一部分序列（reads），抽取序列的数目是随机的，然后统计每次抽取出来的序列中含有多少个 OTU （也就代表了有多少个物种），最后以抽取的序列数目为横坐标，相应的 OUT 数目为纵坐标，绘制曲线。C 组 、R 组 和 Z 组 3 组 对 比 稀释曲 线 均 趋 于平缓并且曲线最终接近重合， 表明此次测序所得到的 OTU 数量差别很小，本次测序数据量合理。

2.5 Shannon-Wiener 曲线 

Shannon-Wiener[11]是用来评价样本中微生物群落多样性的一个指数。 利用各样本的不同测序深度为横坐标， 用各个测序深度所对应的样本多样性指数为纵坐标构建曲线， 从而反映各个样本在不同测序深度时的微生物种类的多样性。 当最后曲线趋向平坦时，说明本次测序的数据数量足够大，不需要加测更多数据，即可以反映各个样本中绝大多数的微生物存在情况。C 组、R 组 和 Z 组 3 组 Shannon 指 数 曲 线 均 趋于平缓并且曲线最终接近重合， 表明此次测序数据量合理，可以反映样本中大多数微生物的信息。

2.6 Venn 图分析 

Venn 图[12]可以用来表示多个样本中所单独具有的 OTU 数目以及所共有的 OTU数目， 可以很直观的表示各组样本 OTU 数目的组成情况以及重叠情况。 通常我们在分析时选用97%相似水平的 OTU 样本表。自闭症组治疗前（R 组）共得到 596 种 OTU，自闭症组治疗后（C 组）共得到 527 种 OTU，健康对照组（Z 组）获得 505 种 OTU，R 组和 C 组共同有的 OTU 数量为 500 个，R 组和 Z 组共同有的OTU 数量为 434 个 ，C 组 和 Z 组 共 同 有的 OTU 数量为 419 个。注：R 组：自闭症组治疗前 C 组：自闭症组治疗后 Z 组：健康对照组

2.7 群 落 结 构组 分 图 

根 据 对分 类 学 结 果 进行分

析，可以了解到各个样品在各级分类水平（门、科、

种、属）的分类学比较情况。 从结果中我们不仅可以看到样本中微生物的种类有哪些， 还可以了解到样本中各微生物的丰度情况。 分别从门水平和属水平对本次研究的对象进行比较分析如下。 在 3个组当中，硬壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变形菌门占绝大多数， 其中硬壁菌门在各个组丰度均最

高，C 组和 R 组门水平丰度梯度依次是： 硬壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门，而 Z 组门水平丰度梯度依次是：硬壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、变 形 菌 门 。 在 属 水 平 Escherichia -Shigella、[Eubacterium] coprostanolige-nes group R 组比 C 组

丰度高，克雷伯氏菌（Klebsiella）只存在于 R 组和

C 组中，且 C 组比 R 组 丰 度 低 。 由 此 可 见 ，自 闭 症患者肠道微生物群中志贺菌属、 克雷伯菌属和荣球菌属丰度明显增高， 其中志贺菌属变化最显著。

3 讨论

自闭症谱系障碍影响约 1%的人口，许多自闭症儿童的紊乱使临床治疗复杂化， 并导致了行为问题， 了解这些胃肠道问题的分子基础和微生物基础对于阐明发病机制、 做出诊断和实施知情治疗至关重要。 此次研究通过对自闭症组与健康对照组肠道菌群分布多样性的比较， 发现两组人群肠道菌群的多样性与丰度的确存在着显著的差异，并将这种鲜为人知的细菌推向了前沿。 其中在属的水平上， 与健康人群相比自闭症组中拟杆菌属 (Bacteroides)、 粪 杆 菌 属 (Faecalibacterium)、Escherichia -Shigella、 韦 荣 氏 球 菌 （Veillonella)、 克雷 伯 氏 菌 （Klebsiella)、 黄 杆 菌 （Flavornifractor)、subdoligranulum 菌 丰 度 升 高 ， 双 歧 杆 菌 属(Bifidobacterium)、 布 劳 特 氏 菌 (Blautia)、 普 氏 菌（prevotella）、Megamonas 菌 、 瘤 胃 球 菌（Ruminococcaceae） 丰 度 降 低 ，Holdemanella 菌 缺如，这与相关文献报道的结果基本一致[13,14]。 经过一段时间治疗后， 患者组的肠道微生物菌群发生了相应改变-梭杆菌门的比例下降， 其中志贺菌属、克雷伯菌属和韦荣球菌属随着自闭症症状缓解而显著下降。 而 Finegold SM 却发现[15]严重自闭症儿童的粪便中脱硫弧菌（一种普通拟杆菌）的数量明显高于对照组，且自闭症组以拟杆菌门为主，对照组以硬壁菌门为主， 这在我们此次研究中并没有表现出来，这可能是由于环境差异所导致，两国环境不同，且西方人口来源呈现一种更多样性变化。同时 Kang DW 发现[16]， 在 自 闭 症 组 中 ， 普 氏 菌（prevotella）、 粪 球 菌 （Coprococcus） 和 韦荣 氏 球 菌（Veillonellaceae)有明显的较低的丰度，这与我们此次研究结果也不太相同， 由于这几种菌都是多水化合物和/或发酵细菌， 因此导致这种差异的可能是由于西方国家与我国饮食模式有较大的差异，也有可能是纳入本次研究的病例数受限， 还需继续扩大样本量来进一步的验证。 通过本研究可以看出自闭症患儿与健康儿童肠道中确实存在某些特定的菌群差异， 这可能与自闭症的发生发展有关。 对这些稀有菌群的进一步研究，这将会对未来特定的诊断测试，流行病学、预防和治疗产生较大影响。

参考文献

[1]熊絮茸. 儿童 自闭症及其综合干预[J]. 医学 与哲 学, 2013, 34(4B):76-78.

[2]邵江洁,姜华,邱晓露,等.音乐治疗 干预 孤独症 儿童 的疗 效观 察[J].江西医药,2014,49(11):1282-1286.

[3]Fond G, Boukouaci W, Chevalier G, Regnault A, Eberl G, HamdaniN, Dickerson F, Macgregor A, Boyer L, Dargel A, Oliveira J,Tamouza R, Leboyer M. The “psychomicrobiotic”: Targetingmicrobiota in major psychiatric disorders: A systematic review [J].Pathol Biol (Paris) 2015,63: 35-42.

[4]Wang Y, Kasper LH. The role of microbiome in central nervoussystem disorders. Brain Behav Immun 2014,38: 1-12 .

[5] 王 蕊 艳 , 蔡 兰 云 . 儿 童 孤 独 症 的 免 疫 学 研 究 进 展 [J]. 江 西 医 药 ,2006,41(8):710-712.

[6]Bercik P. The microbiota -gut -brain axis: learning from intestinalbacteria[J]. Gut,2011,60(3): 288-289.

[7]陈 志 华,张 凤梅.不 同 亚 型 肠 易 激 综 合 征 病人的 肠 道 菌 群状况 研究[J].江西医药,2014,49(12):1459-1461.

[8]Forsythe P, Sudo N, Dinan T, et al. Mood and gut feelings[J]. BrainBehav Immun, 2010, 24: 9-16.

[9]Hrabak J, Chudackovae, Walkovar. Matrix assisted laser desorptionionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometry for detectionof antibiotic resistance mechanisms: from research to routinediagnosis [J].Clin Microbiol Rev,2013,26:103-114.

[10]Nagy E, Becer S, Kostrzewa M, et al. The value of MALDI -TOFFMS for the identification of clinically relevant anaerobic bacteriain routine laboraories [J]. J Med Microbiol,2012,61:1393-1400.

[11]Amato KR, Yeoman CJ, Kent A, et al. Habitat degradationimpacts black howler monkey (alouatta pigra) gastrointestinalmicrobiomes [J]. The ISME J, 2013,7(7):1344.

[12]Fouts DE, Szpakowski S, Purushe J, et al. Next generationsequencing to define prokaryotic and fungal diversity in the bovinerumen [J]. Plo S One, 2012,7(11):e48289.

[13]Mangiola F, Ianiro G, Franceschi F, et al. Gut microbiota inautism and mood disorders [J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(1):361-368.

[14]Shin N -R, Whon T W, Bae J -W. Proteobacteria: microbialsignature of dysbiosis in gut microbiota [J]. Trends inBiotechnology, 2015, 33(9): 496-503.

[15]Finegold SM, Dowd SE, Gontcharova V, Liu C, Henley KE,Wolcott RD, Youn E, Summanen PH, Granpeesheh D, Dixon D,Liu M, Molitoris DR, Green JA. Pyrosequencing study of fecalmicroflora of autistic and control children [J]. Anaerobe, 2010,16:444-453.

[16]Kang DW, Park JG, Ilhan ZE, Wallstrom G, Labaer J, Adams JB,Krajmalnik -Brown R. Reduced incidence of Prevotella and otherfermenters in intestinal microflora of autistic children[J]. PLo S One2013,8: e68322.