​雷帕霉素孕期干预对子代自闭症模型大鼠认知功能的影响

杨丽勤1，2，朱静1，2，徐文婷1，2，徐诗逸1，2，卫志成1，2，秦雯1，汪萌芽11皖南医学院细胞电生理研究室，2生理学省级重点学科“启明星”小组，芜湖241002，安徽

摘要目的:观察雷帕霉素孕期干预对子代自闭症模型大鼠认知功能的影响。方法:取14只孕鼠随机分为正常组(n=3)、模型组(n=4)、雷帕霉素(RAPA)对照组(n=3)和干预组(n=4)，其中模型组和干预组孕12．5d大鼠用丙戊酸钠(VPA)600mg/kg一次性腹腔注射制备子代自闭症模型，RAPA对照组和干预组从孕13d开始每天给孕鼠灌胃RAPA4mg/kg直至子代大鼠23d断奶，正常组和模型组孕鼠给予溶剂麻油对照。在上述4组孕鼠生产后取全部子代雄性幼鼠分别为15，27，21和26只，进行行为学检测鉴定模型，并进一步检测子代大鼠的机械刺激缩足反应阈值(PWMT)、不同光强度下的甩尾反射潜伏期(TFL)和学习记忆功能。结果:模型组大鼠的生长发育指标和探究行为能力均低于正常组，且较正常组大鼠有强烈的重复刻板行为(P＜0．05)，而干预组与模型组的各项检测指标相比均呈逆转(P＜0．05);模型组大鼠的PWMT较正常组升高(P＜0．01)，干预组大鼠的PWMT较模型组降低(P＜0．01);4组大鼠的TFL均呈现随光刺激强度增强而缩短的时反应量-效关系(TDRR,P<0．01)，其中模型组大鼠的TDRR曲线较正常组右移(P＜0．01)，干预组较模型组左移(P<0．01)，并在光强度34、51、76时模型组的TFL较正常组延长(P＜0．01)，干预组较模型组缩短(P＜0．01);Morris水迷宫实验的空间探索检测中，模型组的大鼠穿越原平台位置的次数较正常组减少(P＜0．01)，干预组较模型组增加(P＜0．05)。结论:雷帕霉素孕期干预对子代自闭症模型大鼠的行为障碍、痛觉耐受及记忆能力都有一定程度的缓解作用。
关键词自闭症;雷帕霉素;痛觉;时反应量-效关系;学习记忆

自闭症又称孤独症(autism)，是一种发生在儿童发育早期的广泛性神经发育障碍性疾病［1］，临床上以社会交往障碍、语言沟通障碍、行为刻板重复等为核心症状［2］。有研究显示，认知障碍是自闭症临床特征的主要方面，三大核心症状中的社会交往障碍和语言沟通障碍都存在认知障碍的基础，并表现出学习、记忆、情感等方面的认知缺陷［3］;同时，有研究发现自闭症患者的感知觉尤其是痛觉的异常［4-5］是导致其出现自我伤害或伤害他人行为的重要原因。因而如果可以缓解自闭症患者认知功能方面的障碍则可在一定程度上提升自闭症患者的生活质量。雷帕霉素(rapamycin，RAPA)是一种新型大环内酯类免疫抑制剂，在人体内的特异性结合蛋白为哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)［6］，该蛋白是一种结构和功能保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，广泛分布于神经系统，参与神经突触可塑性变化的调节［7］，可协调蛋白质的生物合成和降解，参与大脑的形成与发育、学习与记忆等过程［8］，并且与疼痛密切相关［9］。有文献报道雷帕霉素可以通过mTOR信号通路诱导和促进细胞自噬的发生［10］，对子代自闭症大鼠病症的行为有一定的改善作用［11］，但雷帕霉素的孕期干预对子代自闭症大鼠的学习记忆功能及其痛觉敏感性的作用仍不清楚，因此本文运用雷帕霉素干预孕鼠，观察其对子代自闭症模型大鼠认知功能等方面的影响。

1材料和方法

1．1实验动物SPF级别250～300g成年雌性SD大鼠20只，300～350g成年雄性SD大鼠10只，由南京青龙山动物繁殖场提供，许可证号:SCXK(苏)2017-0001。

1．2仪器和药品SMART视频监控系统(SanDiegoInstruments，USA)，光辐射热测痛仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)，VonFrey纤维丝刺激针(VonFreyhairs测痛仪)，Morris水迷宫，自制倾斜木板，丙戊酸钠(合肥拜尔迪化学科技有限公司)，雷帕霉素(合肥拜尔迪化学科技有限公司)，生理盐水(扬州中宝制药公司)，75%酒精(天津市百世化工有限公司)等。
1．3孕鼠制备参照Schnerder等［12］实验方法，将雌雄大鼠以2∶1比例合笼过夜，次日早晨对雌鼠进行阴栓观察和阴道涂片检查，发现阴栓或者精子则鉴定为妊娠第0．5天(E0．5d)，并将孕鼠单独饲养，后将其随机分组，为正常组孕鼠3只，模型组孕鼠4只，RAPA对照组孕鼠3只，干预组孕鼠4只。

1．4模型建立及药物干预在E12．5d时给模型组和干预组孕鼠一次性腹腔注射丙戊酸钠(剂量为600mg/kg)，同时给RAPA对照组和正常组孕鼠腹腔注射等容量的生理盐水［13］;此后，RAPA对照组及干预组孕鼠每天给予雷帕霉素(剂量4mg/kg)灌胃直至幼鼠23d断奶，另外2组孕鼠给予等容量溶剂麻油。
1．4．1体质量检测分别在幼鼠出生后第1、7、14、21、28、35天检查幼鼠体质量发育情况，每天中午12∶00称量幼鼠的体质量并逐一记录。
1．4．2睁眼情况检测分别观察幼鼠在出生后第12、13、14、15、16天的睁眼情况，每天下午13∶00逐一检查幼鼠睁眼情况并记录评分，具体评分标准如下:(1)0分，两侧眼睛未睁开;(2)1分，ChinJClinPharmacolTher2022Aug;27(8)单侧眼睛睁开;(3)2分，两侧眼睛睁开。
1．4．3方向趋向能力检测在幼鼠出生后第7、8、9、10天，每天下午14∶00取幼鼠头朝下置于倾角为25°的光滑斜面上，记录幼鼠完全转动180°所用时间，即为幼鼠方向趋向能力检测时间［14］。1．4．4游泳行为检测在幼鼠出生后第9、11、13、15天，每天下午15∶00将幼鼠依次放置在水温保持为20～25℃的恒温水箱中，观察幼鼠自主游泳5～10s，根据水面处于幼鼠头部及其耳朵的具体位置进行逐一评分并记录［14］:(1)0分，幼鼠头顶及其鼻子都在水位线以下;(2)1分，幼鼠头顶位于水面之上，鼻子位于水位线以下;(3)2分，幼鼠头顶和鼻子至少与水位线持平，且两侧耳朵位于水位线以下;(4)3分，幼鼠头顶和鼻子至少与水位线持平，且两侧耳朵位于水位线中间;(5)4分，幼鼠头顶和鼻子至少与水位线持平，且两侧耳朵位于水位线以上。
1．4．5刻板行为检测在幼鼠出生后第22天中午12∶00进行刻板行为检测，采用摄像仪器随机对各组幼鼠自主活动进行录像，时间为60min，观察幼鼠自主活动，对幼鼠重复刻板行为进行评分［15］:(1)0分，幼鼠不存在重复刻板行为;(2)1分，幼鼠存在疑似重复刻板行为;(3)2分，幼鼠存在重复刻板行为。
1．4．6旷场试验检测在幼鼠出生后第28天进行旷场实验检测，观察幼鼠的社会活动及其探究行为，即对幼鼠旷场试验中的中央区停留时间和垂直站立次数进行检测，时间为5min。

1．5机械痛阈值检测分别于幼鼠出生后第21、28、35天用VonFrey纤维丝刺激针(VonFreyhairs测痛仪)检测大鼠的机械刺激缩足反应阈值(PWMT)［16］。将待测幼鼠放置于用透明亚克力活动盒罩住的金属网孔上，幼鼠足底完全暴露于疼痛测试架上，待幼鼠稳定15～30min后，对幼鼠采用机械触痛法检测PWMT:将能够引起等于或大于3/5次抬腿比例的最低VonFrey纤毛克数定义为幼鼠的PWMT。

1．6光辐射热痛甩尾潜伏期检测通过光辐射热测痛仪对出生后第35天的幼大鼠用移位法进行不同光照强度下甩尾反应潜伏期(TFL)的检测［17］，即首次在距鼠尾根部1cm处，随后每隔0．5cm依次后移光照位点，进行5个光照强度的检测(TDRR检测)。设定光辐射热测痛仪的光照强度(Focus值)为23、34、51、76，随后依次测定各幼大鼠在不同光强下的TFL。

1．7Morris水迷宫实验实验前随机选定1个目标象限。第1天适应性训练:将站台置于水池的中央，先将大鼠置于站台上适应20s，随后将大鼠按随机顺序从三个不同象限面壁置入池内，记录大鼠从入水到登上站台的时间，最长记录时间为60s，若大鼠在60s内不能上台，引导其登上站台适应10s，最后将大鼠擦干放入鼠笼。从第2天开始定位航行训练:将站台置于水池的中央与目标象限连线的中点处，重复适应性训练的操作4次(四个象限)，测量大鼠平均登上站台的逃避潜伏期，以检测大鼠的空间学习能力，连续5d分别重复上述步骤。最后一天空间探索:撤除水面下的站台，将大鼠在目标象限的对侧象限面壁置入池内1次，记录大鼠在60s内第一次到达原平台位置的时间、在靶象限活动时间和穿越原平台位置次数，以检测大鼠的空间记忆能力［14］。

1．8统计学处理使用SPSS18．0软件进行数据的统计分析，结果用均数±标准差(x±s)或中位数(四分位间距)表示。其中体质量检测、方向趋向能力检测、第一次睁眼天数、旷场中央区停留时间以及垂直站立次数主要采用单因素方差分析;睁眼评分、游泳行为检测评分、刻板行为检测评分主要采用秩和检验分析;VonFrey纤维丝测痛实验、光辐射热痛实验检测数据和Morris水迷宫检测数据主要采用重复测量双因素方差分析和单因素方差分析，P＜0．05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1子代大鼠出生后的行为学检测结果

模型组大鼠的各项生长发育指标均低于正常组(P<0．05)，且模型组较正常组大鼠有更为强烈的重复刻板行为和较少的探究行为(P＜0．05，Fig．1)，结果表明模型组的生长发育较正常组迟缓且存在行为障碍，子代自闭症大鼠模型成功建立。与此对比，干预组与模型组相比均成逆转(P＜0．05)，提示雷帕霉素的孕期干预对子代自闭症模型大鼠的发育迟缓和行为障碍有缓解作用。

2．2机械刺激缩足反应阈值(PWMT)检测结果

模型组大鼠的PWMT较正常组大鼠升高(P<0．01)，干预组大鼠的PWMT较模型组大鼠降低(P＜0．01，Fig．2)，结果表示子代自闭症大鼠模型的机械痛阈值较正常显著耐受，雷帕霉素孕期干预可一定程度上降低子代自闭症模型大鼠的痛觉耐受。

2．3光辐射热痛觉TDRR检测结果

4组大鼠的TFL均呈现随光刺激强度增强而缩短的TDRR(P＜0．01)，其中模型组大鼠的TDRR曲线较正常组右移(P＜0．01)，干预组较模型组左移(P<0．01)，并在光强度34、51、76时模型组的TFL较正常组延长(P＜0．01)，干预组较模型组缩短(P＜0．01，Fig．3，Tab．1)，并且四组大鼠在强度23时的TFL均为最大值15s，结果表示子代自闭症大鼠模型的热辐射甩尾潜伏期较正常显著耐受，雷帕霉素孕期干预可一定程度上降低子代自闭症模型大鼠的痛觉耐受。

2．4Morris水迷宫实验结果

定位航行实验中，模型组的逃避潜伏期仅稍长于正常组(P＞0．05);在空间探索实验中，模型组的大鼠穿越原平台位置的次数较正常组减少(P＜0．01)，干预组较模型组增加(P＜0．05，Fig．4)，结果表示子代自闭症模型组大鼠的记忆功能较正常组显著减弱，雷帕霉素孕期干预可一定程度上缓解其记忆功能障碍。

3讨论

本实验采用啮齿类动物自闭症造模方法［18］———在大鼠孕12．5d一次性腹腔注射丙戊酸钠来制备子代自闭症大鼠模型，从孕13d开始连续对孕鼠给予雷帕霉素灌胃干预，自子代鼠出生后通过行为学检测来观察、比较行为学差异，并进一步检测其痛觉和学习记忆功能的变化，以探究雷帕霉素孕期干预对子代自闭症模型大鼠的行为活动、痛觉及学习记忆功能的影响。
自子代大鼠出生后，通过行为学检测发现，模型组大鼠在体质量生长、前庭发育及身体的平衡机能方面均较正常组低下，并且通过观察，模型组有明显的重复刻板行为和较弱的探索能力，可判定模型组子代大鼠为成功制备的子代自闭症大鼠模型［19］。与此对比，干预组与模型组相比均成逆转，干预组的行为学检测指标同正常组相似，其行为、发育指标接近正常，提示雷帕霉素的孕期干预对子代自闭症模型大鼠的发育迟缓和行为障碍有一定的缓解作用。随后，对所有子代大鼠进行痛觉和学习记忆能力检测。在痛觉方面，实验检测结果显示模型组的PWMT较正常组显著上升，热辐射痛TFL较正常组显著延长，干预组大鼠的PWMT和热辐射痛TFL都较模型组下降，但与正常组相似;随后将子代大鼠痛觉甩尾潜伏期随刺激强度的时反应量-效关系变化根据双曲线模型Y=cs+1/(x－a)s+b进行拟合［20］，发现模型组拟合的曲度参数c值较另外三组都大，表示模型组随光强度刺激其TFL的变化较另外3组更广;反应参数b值可反映大鼠的最短TFL值变化，模型组的b值相较最大，干预组较模型组减小，以上结果均提示子代自闭症模型大鼠的痛觉较正常组显著耐受，与临床报道一致［5，21］。实验结果还显示，干预组通过孕期干预可一定程度缓解自闭症大鼠的痛觉耐受，并可使其恢复到接近正常水平。结合文献报道，雷帕霉素可通过抑制mTOR通路参与神经病理疼痛的调节并在减轻CCI模型大鼠的痛觉方面具有重要作用［22］，同时，雷帕霉素还可通过调节mTOR通路来达到痛觉敏化的作用［9，23］。在本实验中，雷帕霉素孕期干预组的结果也充分显示其对自闭症模型大鼠的痛觉耐受的缓解作用，进一步表明雷帕霉素可能通过其内在分子作用调节痛觉的变化。在学习记忆方面，研究结果显示在Morris水迷宫空间探索实验中，模型组大鼠穿越平台的次数较正常组下降，干预组大鼠较模型组上升，提示模型组的记忆能力较正常组显著下降，同临床变化相符［3，24］。有研究证明，雷帕霉素可通过阻断mTOR通路，调控蛋白的合成与稳定，继而影响突触可塑性，从而增强学习记忆功能［25-26］，说明雷帕霉素孕期干预可能通过此机制增强子代自闭症大鼠的记忆能力。综上，雷帕霉素孕期干预对子代自闭症模型大鼠的行为障碍、痛觉耐受及记忆能力都有一定程度的缓解作用。
不过，自闭症是一种多因素疾病，具体的病因及发病机制不明。随着社会发展，自闭症的发病率也在逐年提升，引起了社会的广泛关注，并有诸多学者对其进行不懈地探索。但目前临床上对于此病的治疗仍以行为干预治疗为主，鲜少应用药物干预治疗［27］。本实验通过药物造模，构建子代自闭症大鼠模型，进一步运用雷帕霉素干预孕鼠，在子代大鼠出生后对其行为、痛觉及学习记忆功能进行检测，实验结果显示雷帕霉素可在一定程度上对自闭症模型大鼠的行为障碍、痛觉耐受及记忆能力具有改善作用，由此可为自闭症患者在药物干预治疗方面奠定一定的研究基础，但其中雷帕霉素在本实验过程中所发挥的具体作用机制仍需进一步研究。本实验仅于动物行为学方面有一定的探索和发现，但仍未从药物作用的分子机制及其内在信号转导方面展开进一步的探索，且本实验中重要的研究通路mTOR在多个领域多个层面涉及各种不同的作用，可于后期展开详细的研究和探讨。

参考文献

［1］RaulstonTJ，HansenSG，MachalicekW，etal．Interventionsforrepetitivebehaviorinyoungchildrenwithautism:Asurveyofbehavioralpractices［J］．JAutismDevDisord，2019，49(8):3047-3059.
［2］StPourcainB，RobinsonEB，AnttilaV，etal．ASDandschizophreniashowdistinctdevelopmentalprofilesincommongeneticoverlapwithpopulationbasedsocialcommunicationdifficulties［J］．MolPsychiatry，2018，23(2):263-270.
［3］黄俊，王滔．自闭症谱系障碍社会认知缺陷的神经机制:来自fNIRS的证据［J］．中国特殊教育，2020，(6):32-38.
［4］AllelyCS．Painsensitivityandobserverperceptionofpaininindividualswithautisticspectrumdisorder［J］．SciWorldJ，2013，2013:916178.
［5］许萌，李齐，HongyiSui，等．孤独症谱系障碍儿童及模型鼠痛觉敏感特征［J］．中国学校卫生，2021，42(5):756-758.
［6］LiuGY，SabatiniDM．mTORatthenexusofnutrition，growth，ageinganddisease［J］．NatRevMolCellBiol，2020，21(4):183-203.
［7］YinZ，ParkR,ChoiBM．IsoparvifuranisolatedfromDalbergiaodoriferaattenuatesH2O2inducedsenescenceofBJcellsthroughSIRT1activationandAKT/mTORpathwayinhibition［J］．BiochemBiophysResCommun，2020，533(4):925-931.
［8］易善志，刘汉东．SB-399885阻断5-羟色胺6受体/雷帕霉素靶蛋白途径对精神分裂症大鼠认知和记忆障碍的改善作用［J］．神经疾病与精神卫生，2020，20(4):251-257.
［9］杨文茜，郭曲练，程智刚，等．脊髓哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路参与大鼠外周神经损伤诱发的痛觉过敏［J］．中南大学学报(医学版)，2019，44(4):377-385.
［10］XuZ，HanX，OuD，etal．TargetingPI3K/AK/mTORmediatedautophagyfortumortherapy［J］．ApplMicrobiolBiotechnol，2020，104(2):575-587.
［11］秦利燕，戴旭芳．雷帕霉素对自闭症大鼠病症行为的改善作用［J］．第三军医大学学报，2015，37(5):420-424.
［12］SchneiderT，PrzewlockiR.Behavioralalterationsinratsprenatallyexposedtovalproicacid:animalmodelofautism［J］．Neuropsychopharmacology，2005，30(1):80-89.
［13］郑文霞，胡宇玲，陈笛，等．丙戊酸钠诱导小鼠自闭症模型的改良［J］．南方医科大学学报，2019，39(6):718-723.
［14］魏渼淇，刘忠民，冯广智．不同干预方式对ASD大鼠认知能力的影响及机制探讨［J］．实验动物科学，2021，38(3):47-53.
［15］NaiglesLR,ChengM，RattansoneNX，etal．"Youetellingme!"Theprevalenceandpredictorsofpronounreversalsinchildrenwithautismspectrumdisordersandtypicaldevelopment［J］.ResAutismSpectrDis-ord，2016，27:11-20.
［16］GuoJR,WangH，JinXJ，etal．Effectandmecha-nismofinhibitionofPI3K/Akt/mTORsignalpathwayonchronicneuropathicpainandspinalmicrogliainaratmodelofchronicconstrictioninjury［J］．Oncotar-get，2017，8(32):52923-52934.
［17］余雪霏，张铭勋，方博文，等．大鼠光辐射热甩尾试验的时反应量-效关系［J］．皖南医学院学报，2014，33(2):176-180.
［18］雷雨溪，何慕兰，赖茜，等．两种孤独症谱系障碍大鼠模型的构建及比较［J］．重庆医科大学学报，2018，43(9):1132-1139.
［19］GuYY，HanY，LiangJJ，etal．Sexspecificdifferencesinthegutmicrobiotaandfecalmetabolitesinanadolescentvalproicacidinducedratautismmodel［J］．FrontBiosci(LandmarkEd)，2021，26(12):1585-1598.
［20］杨丽勤，李峙玉，檀沛，等．自闭症模型大鼠的痛觉时反应量-效关系［J］．中国临床药理学与治疗学，2019，24(12):1341-1346.
［21］李晋，宋天佳，孟凡超，等．孤独症与正常儿童的痛阈比较研究［J］．中国疼痛医学杂志，2015，21(12):908-913.
［22］DuanZ，LiJ，PangX，etal．Blockingmammaliantargetofrapamycin(mTOR)alleviatesneuropathicpaininducedbychemotherapeuticbortezomib［J］.CellPhysiolBiochem，2018，48(1):54-62.
［23］LiuYD，WangZB，HanG，etal．HyperbaricoxygenrelievesneuropathicpainthroughAKT/TSC2/mTORpathwayactivitytoinduceautophagy［J］．JPainRes，2019，12:443-451.
［24］赵万兴，吴燕楠，郑董雯，等．孤独症谱系障碍个体工作记忆干预的研究进展［J］．杭州师范大学学报(自然科学版)，2022，21(3):268-275.
［25］崔晓丽，魏振，沈辉，等．雷帕霉素改善APOE4/5xFAD转基因小鼠早期认知障碍的作用机制研究［J］．福建医药杂志，2020，42(5):137-139.
［26］SperlingRA，DonohueMC，RamanR,etal．Associationoffactorswithelevatedamyloidburdeninclinicallynormalolderindividuals［J］．JAMANeurol，2020，77(6):735-745.
［27］张红梅，薛曼，王斌，等．孤独症谱系障碍早期遗传诊断和治疗研究进展［J］．中华精神科杂志，2022，55(3):232-237.