孕期丙戊酸暴露对自闭症子代大鼠不同肠段菌群分布特征的影响①

亓照耀 袁海燕 翟林林 曹赟 刘娟 吴艳艳 袁铭 胡婷 杨丽萍
（河南中医药大学，郑州450046）

［摘要］目的：探讨孕期丙戊酸（VPA）暴露对28日龄子代自闭症大鼠肠道不同部位菌群的影响，为VPA自闭症大鼠模型肠道菌群相关研究提供参考。方法：选取受孕0.5d孕鼠随机分为正常组和模型组，仔鼠延续孕鼠分组。模型组受孕12.5d时按600mg/kg腹腔注射丙戊酸钠溶液，通过行为学评价仔鼠模型是否构建成功，正常组腹腔注射无菌生理盐水并正常喂养至分娩，其仔鼠为正常组。对建模成功的雄性仔鼠采用随机数字表法从每组中分别选取4只进行四个肠段内容物取材。采用16SrRNA基因的高通量扩增测序对仔鼠十二指肠、空肠、结肠和直肠部位的肠道内容物菌群样本进行微生物多样性分析。结果：与正常组相比，模型组仔鼠旷场实验评分和社交时间均明显降低（P<0.05），而刻板行为评分升高（P<0.05）。正常组十二指肠和空肠部位的菌群丰富度和多样性均降低且分布一致（P<0.05），结肠部位和直肠部位菌群分布一致（R2=0.478，P=0.001）。模型组空肠部位的丰富度和多样性降低（P<0.05），不同部位无明显分布差异。与正常组相比，模型组十二指肠部位（R2=0.254，P=0.001）、空肠部位（R2=0.187，P=0.001）和直肠部位（R2=0.175，P=0.021）菌群相似性存在差异，其中十二指肠部位组间差异最大。与正常组相比，在属水平，模型组十二指肠部位Allobaculum属相对丰度提高，乳酸菌属、Romboutsia属、双歧杆菌属和Dubosiella属相对丰度降低；直肠部位乳酸菌属和Prevotellaceae_NK3B31相对丰度增加，Allobaculum属、Dubosiella属和Rom⁃boutsia属相对丰度降低。结论：VPA自闭症模型大鼠不同部位的肠道菌群出现了不同程度的紊乱，孕期VPA暴露破坏了其子代十二指肠和空肠部位的菌群特异性，这可能是菌群改变的原因。

自闭症（autismspectrumdisorders，ASD）是一种神经发育障碍性疾病，其患病率呈逐年上升趋势。但是，目前针对自闭症无特效疗法，给患者家庭和社会带来巨大负担。值得注意的是，ASD与孕期的各种危险因素暴露关系密切［1-2］，但是其具体发病原因尚未阐明。目前证据表明，自闭症患儿易伴随出现各种胃肠道疾病［3］。此外还发现自闭症患者的肠道菌群存在不同程度紊乱，越来越多的证据也表明肠道菌群和大脑发育具有密切关系［4-7］。
丙戊酸（valproicacid，VPA）是一种广谱抗癫痫药物，孕期暴露VPA会增加子代患自闭症风险。目前利用孕期暴露VPA建立子代自闭症大鼠模型成为经典的自闭症模型建模方法［8-9］。尽管曾有报道称VPA大鼠模型很好地模拟了自闭症患者的肠道菌群失调情况［10-11］。但是，这些研究仅分析了模型大鼠的粪便菌群情况，对于不同肠道部位菌群情况的探究还存在空白。本研究对VPA自闭症模型大鼠的不同肠道部位菌群改变和分布特征进行分析，能够很好补充ASD与肠道菌群相关研究，为探讨ASD发病机制及治疗思路提供参考。

1材料与方法

1.1材料

Wistar大鼠18只［北京维通利华实验动物公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006；合格证号：11400700319215］，雌雄比例2∶1，体质量雄270~310g，雌170～220g。丙戊酸钠（VPA钠盐）（Sigma，批号：1008A021）。本实验经过河南中医药大学动物伦理委员会审查（许可证号：DWLL2018030017），在河南中医药大学实验动物中心进行，饲养环境为温度（18±5）℃、湿度（35±10）%和12h明暗循环。

1.2方法

1.2.1建模方法适应性喂养1周后，选取体格较强壮的大鼠（雌∶雄=2∶1）在21：00合笼，次日7：00检查是否有阴栓，若有记为受孕0.5d，反之继续合笼。将成功受孕的10只雌鼠按随机数字表法平均分为正常组和模型组。所有仔鼠延续孕鼠分组饲养至28日龄。模型组的孕鼠受孕12.5d，按600mg/kg剂量腹腔注射VPA钠盐溶液（丙戊酸钠加生理盐水配成浓度250mg/ml的溶液），分娩后利用行为学实验选取合格的雄性仔鼠为自闭症模型组；正常组的孕鼠用无菌生理盐水代替VPA钠盐溶液进行相同操作，分娩仔鼠为正常组。
1.2.2行为学评价从正常组和模型组的28日龄雄性仔鼠中每窝随机选取2只，开展行为学测试。测试期间保持环境安静和光线恒定，更换动物时用75%乙醇擦拭测试箱内壁和底面，清除前一动物遗留的气味。摄像机连接于测试箱正上方100cm处，收集动物的活动视频、运动轨迹和相关数据，并利用ANY-maze动物行为学视频分析系统进行行为学分析。
1.2.3旷场实验旷场测试箱（100cm×100cm×45cm）底面分为5×5正方形小格（20cm×20cm）。抓住大鼠尾根尖1/3处提起，轻轻放入测试箱正中格，适应1min后，记录3min内大鼠的水平评分（双后肢穿过一格记1分）、垂直评分（双前肢离地直立一次记1分）。
1.2.4社交实验社交测试箱（60cm×45cm×25cm）被等分为3个测试间（20cm×45cm×25cm）。房间隔断中间有通道，两侧房间内下角放置圆柱社交笼（直径12cm），笼周围设为社交区域（直径18cm）。测试前随机选一侧社交笼放入社交鼠，中间房间放入测试鼠。测试鼠头部进入社交房间（社交鼠所在房间）社交区域的次数为社交次数，在社交区域时间为社交时间。
1.2.5刻板行为观察实验刻板行为观察测试箱（50cm×50cm×45cm），将测试鼠置于测试箱适应5min后，测试15min，通过监控记录测试鼠梳理身上任一处毛发的次数和总时间。每只大鼠测试2次后取均值，记录结果。
1.2.6肠道微生物取材采用随机数字表法从每组中分别选取4只仔鼠进行4个不同肠段的取材。按0.3ml/100g的10%水合氯醛麻醉后，超净工作台冰面上快速分离肠道组织，吸取出肠内容物后于−80℃冻存。本实验肠道微生物取材的肠道部位具体规定为：十二指肠部位（幽门括约肌向下约1.5cm），空肠部位（空肠的中央部分约2.0cm），结肠部位（结肠的中央部分约2.0cm），直肠部位（肛门近端约2.0cm）。
1.2.7高通量扩增测序肠道菌群样品提取总DNA后，根据V3-V4区域设计得到引物。在引物末端加上测序接头，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库，文库质检后上机测序。对原始测序序列进行双端拼接过滤，去除嵌合体得到优化序列。将优化序列进行聚类，操作分类单元（operationaltaxonomicunits，OTUs），并根据OTUs的序列组成得到其物种分类；基于OTUs分析结果，进行Alpha多样性、Beta多样性分析和组间差异显著性分析。本实验测序的正向引物为：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；反向引物为：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

1.3统计学处理

行为学和多样性指数数据处理采用SPSS23.0软件进行统计学分析，计量资料采用    ±s形式描述。三组及三组以上数据资料，服从正态分布且方差齐采用ANOVA分析，反之采用Krus⁃kal-WallisH检验。肠道菌群的相关数据分析，均使用BMK微生物多样性分析平台（www.biocloud.net）完成，并且采用非加权算法（UnweightedUnifracal⁃gorithm）。Chao1指数代表Alpha丰富度指数，Shan⁃non指数代表Alpha多样性指数。采用相似度分析（ANOSIM）检验两组样本之间的Beta多样性是否存在显著性差异。PCoA主坐标分析（PrincipalCoordi⁃natesAnalysis）法比较不同肠段的菌群一致性。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1仔鼠的行为学评价利用行为学测试评价模型组仔鼠建模是否成功。与正常组相比，模型组仔鼠旷场实验的水平评分和垂直评分降低（P<0.05，图1A），刻板行为观察实验的理毛次数和总理毛时间明显增加（P<0.05，图1B），社交实验的社交时间明显减少社交次数也减少（P<0.05，图1C）。
2.2肠道不同部位菌群丰富度和多样性情况正常组十二指肠和空肠的菌群分布、丰富度和多样性一致，结肠和直肠部位一致（R2=0.478，P=0.001）（图2A、C、E）。与正常组相比，模型组十二指肠菌群丰富度升高（图2A、B），结肠和直肠部位多样性降低（图2C、D，P<0.05）。与正常组相比，模型组肠道不同部位的分布无明显差异（图2F）。
2.3肠道不同部位菌群相似性情况与正常组相比，模型组十二指肠部位（R2=0.254，P=0.001，图3A），空肠部位（R2=0.187，P=0.001，图3B）和直肠部位（R2=0.175，P=0.021，图3D）菌群相似性具有差异，其中十二指肠部位组间差异最大。在门水平，模型组菌群十二指肠和空肠部位的菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）构成。与十二指肠和空肠部位相比，结肠和直肠部位螺旋体菌门（Spirochaetes）的丰度有所增加。不同肠段间相比，空肠部位的厚壁菌门丰度最高（92.81%），直肠部位的拟杆菌门丰度最高（16.13%），结肠部位的螺旋体菌门丰度最高（11.28%，图3E）。
2.4肠道不同部位菌群构成和差异情况在属水平，与正常组相比，模型组十二指肠部位Allobacu⁃    lum属相对丰度增加，乳酸菌属（Lactobacillus）、Rom⁃boutsia属、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和Dubosiella属相对丰度减少（图4A），直肠部位乳酸菌属（Lacto⁃bacillus）和Prevotellaceae_NK3B31_group相对丰度增加，Allobaculum属、Dubosiella属和Romboutsia属相对丰度减少（图4B）。在空肠部位，模型组Allobacu⁃    lum属占优势，正常组Turicibacter属占优势（图4C）。在直肠部位，模型组消化球菌科（Peptococcaceae）占优势，正常组毛螺菌科（Lachnospiraceae）占优势（图4D、E）。

3讨论

ASD发病率已经高达1/59，并呈大幅上升趋势，且男孩患病概率远高于女孩［12］。目前ASD致病机制不明，对ASD的深入研究和诊疗方案的制定都存在巨大挑战，合理的动物模型可以为其深入研究提供帮助。此外，ASD患儿常伴有腹部不适的症状，如便秘、腹泻和腹痛。有研究发现，ASD患儿具有特征肠道菌群，其消化道症状由特定的肠道微生物引起［7］。且肠道菌群稳态在ASD的发生发展中发挥重要作用，很多研究发现ASD患儿和对照者间在肠道菌群上存在差异［4-7］。由此可知，肠道微生物稳态与ASD有关，肠道菌群稳态失衡是ASD发病的重要影响因素。
VPA大鼠模型是研究ASD的经典模型，其不仅在行为学上与ASD患者相近，且在大脑神经发育学上也被证实与ASD患者类似［8-9］。此外，VPA自闭症大鼠模型的肠道菌群改变也与ASD患者相似［10-11］。大鼠的肠道结构和内部环境并不是单一的，具有复杂的生理结构。并且大鼠的肠道结构与人类类似，主要分为十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠，肠道不同部位的微生物类型和分布存在差异［13-14］。
此外，肠道不同部位黏膜细胞的作用也不同，吸收肠道菌群的代谢产物可能也存在差异［13-14］。本研究发现与正常组相比，模型组十二指肠和空肠部位的肠道菌群与结肠和直肠部位的菌群趋于一致，其特异性明显缺失，这可能是模型组肠道菌群紊乱的原因。模型组不同程度的菌群紊乱可能导致了其菌群代谢产物的吸收代谢异常，进而可能影响神经系统的发育。
此外，VPA作为一种孕期暴露的危险因素，其影响肠道菌群的具体机制还不明确。本研究着重比较了不同肠段的菌群丰富度和分布情况。数据表明，模型组的肠道菌群分布与正常组相比表现出明显差异，不同肠段的菌群分布也出现紊乱，特别是结肠部位特征菌数量很少。有研究表明，肠道微生物群在指导和促进大脑发育过程中发挥了作用［15］，如果在肠道微生物构建关键时期发生的紊乱，可能影响ASD的发生、发展过程［16］。更重要的是，肠道微生物早期定植的异常会影响大脑发育，诱发ASD症状［17］。根据本研究数据，孕期VPA暴露可能影响了子代肠道菌群的定植，特别是改变了不同肠段的菌群特异性。
综上所述，VPA自闭症模型大鼠不同部位的肠道菌群出现了不同程度的紊乱，不同肠段肠道菌群特征趋于一致且特征菌减少，特别是十二指肠和空肠部位的肠道菌群差异性缺失。这可能是孕期VPA暴露导致子代肠道菌群紊乱的原因，未来还需要进一步加深对该模型菌群代谢和不同肠段通透性的研究。

参考文献：

［1］ZERBOO，IOSIFAM，WALKERC，etal.Ismaternalinfluenzaorfeverduringpregnancyassociatedwithautismordevelopmen⁃taldelays？ResultsfromtheCHARGE（CHildhoodAutismRisksfromGeneticsandEnvironment）study［J］.JAutismDevDisord，2013，43（1）：25-33.DOI：10.1007/s10803-012-1540-x.
［2］ATLADOTTIRHO，HENRIKSENTB，SCHENDELDE，etal.Autismafterinfection，febrileepisodes，andantibioticuseduringpregnancy：anexploratorystudy［J］.Pediatrics，2012，130（6）：e1447-e1454.DOI：10.1542/peds.2012-1107.
［3］CHAIDEZV，HANSENRL，HERTZPICCIOTTOI.Gastroin⁃testinalproblemsinchildrenwithautism，developmentaldelaysortypicaldevelopment［J］.JAutismDevDisord，2014，44（5）：1117-1127.DOI：10.1007/s10803-013-1973-x.
［4］CORETTIL，PAPAROL，RICCIOMP，etal.Gutmicrobiotafeaturesinyoungchildrenwithautismspectrumdisorders［J］.FrontMicrobiol，2018，9：3146.DOI：10.3389/fmicb.2018.03146.
［5］DEANGELISM，PICCOLOM，VANNINIL，etal.Fecalmicro⁃biotaandmetabolomeofchildrenwithautismandpervasivedevelopmentaldisordernototherwisespecified［J］.PLoSOne，2013，8（10）：e76993.DOI：10.1371/journal.pone.0076993.
［6］KANGDW，ILHANZE，ISERNNG，etal.Differencesinfe⁃calmicrobialmetabolitesandmicrobiotaofchildrenwithautismspectrumdisorders［J］.Anaerobe，2018，49：121-131.DOI：10.1016/j.anaerobe.2017.12.007.
［7］WANGMB，WANJ，RONGH，etal.Alterationsingutgluta⁃matemetabolismassociatedwithchangesingutmicrobiotacom⁃positioninchildrenwithautismspectrumdisorder［J］.mSystems，2019，4（1）：e00321-18.DOI：10.1128/mSystems.00321-18.
［8］SCHNEIDERT，ROMANA，BASTAKAIMA，etal.Genderspecificbehavioralandimmunologicalalterationsinananimalmodelofautisminducedbyprenatalexposuretovalproicacid［J］.Psychoneuroendocrinology，2008，33（6）：728-740.DOI：10.1016/j.psyneuen.2008.02.011.
［9］KUWAGATAM，OGAWAT，SHIODAS，etal.Observationoffetalbraininaratvalproate-inducedautismmodel：adevelop⁃mentalneurotoxicitystudy［J］.IntJDevNeurosci，2009，27（4）：399-405.DOI：10.1016/j.ijdevneu.2009.01.006.
［10］DETHEIJECG，WOPEREISH，RAMADANM，etal.Al⁃teredgutmicrobiotaandactivityinamurinemodelofautismspectrumdisorders［J］.BrainBehavImmunity，2014，37：197-206.DOI：10.1016/j.bbi.2013.12.005.
［11］LIUF，HORTONSPARKSK，HULLV，etal.Thevalproicac⁃idratmodelofautismpresentswithgutbacterialdysbiosissimi⁃lartothatinhumanautism［J］.MolAutism，2018，9：61.DOI：10.1186/s13229-018-0251-3.
［12］BAIOJ，WIGGINSL，CHRISTENSENDL，etal.Prevalenceofautismspectrumdisorderamongchildrenaged8yearsautismanddevelopmentaldisabilitiesmonitoringNetwork，11Sites，UnitedStates，2014［J］.MMWRMorbMortalWklyRep，2018，67（19）：564.DOI：10.15585/mmwr.ss6706a1
［13］WANGY，SONGW，WANGJ，etal.Singlecelltranscriptomeanalysisrevealsdifferentialnutrientabsorptionfunctionsinhu⁃manintestine［J］.JExpMed，2020，217（2）：e20191130.DOI：
10.1084/jem.20191130.
［14］LIN，ZUOB，HUANGS，etal.Spatialheterogeneityofbacte⁃rialcolonizationacrossdifferentgutsegmentsfollowinginterspe⁃ciesmicrobiotatransplantation［J］.Microbiome，2020，8（1）：161.DOI：10.1186/s40168-020-00917-7.
［15］DEVRIEZEJ.Medicalresearch.Thepromiseofpoop［J］.Sci⁃ence（NewYork，NY），2013，341（6149）：954-957.DOI：10.1126/science.341.6149.954.
［16］SHARONG，CRUZNJ，KANGDW，etal.Humangutmicro⁃biotafromautismspectrumdisorderpromotebehavioralsymp⁃tomsinmice［J］.Cell，2019，177（6）：1600-1618.e17.DOI：10.1016/j.cell.2019.05.004.
［17］BORREYE，O'KEEFFEGW，CLARKEG，etal.Microbiotaandneurodevelopmentalwindows：implicationsforbraindisor⁃ders［J］.TrendMolMed，2014，20（9）：509-518.DOI：10.1016/j.molmed.2014.05.002.