自闭症相关Foxpl突变体Y435X的功能研究

涂晓萌，郭志强，李雪厶

(温州医科大学附属眼视光医院，眼视光学和视觉科学国家重点实验室，浙江温州325027)

【摘要】目的：对小鼠FoxplY435X突变体(蛋白序列比对小鼠Y435X等同于人类Y439X)的表达和功能进行研究，探究Y435X突变体与自闭症谱系障碍发病机制之间的联系。方法：通过Westernblot分析小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中Y435X突变体的蛋白表达水平;利用免疫荧光检测N2a细胞及原代小鼠大脑皮质神经元中Y435X突变体的亚细胞定位;采用小鼠子宫内胚胎基因转染技术，分析Y435X突变体对大脑皮质神经元迁移、最终定位及顶树突发育的影响。结果：Westernblot结果显示,Y435X突变体在N2a细胞中产生大约56kD的截短蛋白，与野生型Foxpl相比，表达量明显增加；免疫荧光结果说明，Y435X突变体在胞质中形成聚集体，并导致核膜皱缩;Y435X突变体改变了小鼠岀生后大脑皮质神经元的正常定位及顶树突的生长方向。结论：FoxplY435X突变体在皮质神经元中产生聚集体,并干扰出生后皮质神经元的正常定位及顶树突的生长。

【关键词】自闭症谱系障碍；FoxplY435X突变体；N2a细胞；皮质神经元

【中图分类号】R741.02;R749.94［文献标志码］Adoi：10.3969/j.issn.1000-4718.2021.06.001

自闭症相关Foxpl突变体Y435X的功能研究

基金项目］国家自然科学基金资助项目(No.81571096);浙江省自然科学青年基金资助项目(No.LQ14C090005);温州市基础医疗卫生科技项目

前言

自闭症谱系障碍(autismspectrumdisorder,ASD)，又称孤独性障碍或自闭症，是一类复杂的神经发育疾病,在儿童中发病率高达1%~3%［'-2］OASD致病原因相对复杂，并非单一致病机制的简单失调,多认为是遗传和环境因素共同作用导致的「5。家族和双胞胎的研究分析表明，同卵双生的共患病率高达70%~90%,说明遗传因素在ASD的发生中起着重要作用「气来自父母及患病儿童的全基因组测序分析发现,ASD患者中存在多个新生突变“气因此，针对临床ASD风险基因的生物学功能研究，以及相关突变在大脑发育中的作用分析,将有助于揭示ASD的潜在致病机制。

研究表明，众多自闭症相关基因主要通过调控早期大脑正常发育而发挥作用3”丄ASD被认为与早期大脑发育异常有关。转录因子在这一过程中起到关键作用，可以调控相关基因的时空表达皿。因此,鉴别在ASD发病以及大脑发育过程中关键转录因子调控的基因网络，对于解析自闭症发病机制具有重要指导意义。转录因子FOX家族的成员已被证实与ASD密切相关在多名ASD患者中发现FOXP1杂合子的缺失、点突变以及复制异常阻刃。大规模外显子测序进一步证实,F0XP1是多名ASD患者中的新生突变基因网,这使得FOXPI跻身成为ASD的高风险基因。

为了探索FOXFI突变导致ASD发生的作用机制,本课题克隆了小鼠Foxpl基因的突变体Y435X(蛋白序列比对等同于人Y439X),利用多种分子生物学技术，分析该突变体在细胞中的表达和亚细胞定位，以及在体异位表达对皮质神经元最终定位和形态发生的影响。通过对Foxpl突变体蛋白本身的功能研究，为自闭症等神经系统疾病的分子机理研究开拓了新思路。

材料和方法

1细胞与动物

小鼠神经母细胞瘤N2a细胞购于上海细胞资源中心。原代神经元于无菌条件下取自胚胎期ICR小鼠大脑皮质。清洁级ICR小鼠来自并繁殖于温州医科大学动物学实验室。动物合格证编号为SYXK(浙)2020-0014。小鼠繁育主要通过当天晚上合笼，第2天分笼的方式，见栓则记为胚胎0.5d(E0.5)o所有操作都严格遵循温州医科大学实验动物和动物实验相关管理条例进行。该研究本着实验动物福利和伦理的原则，优化设计方案,严格计划动物需要数量,实验结束后,戊巴比妥钠麻醉小鼠(50mg/kg),使小鼠安乐死。

2主要试剂

2.1细胞培养试剂胎牛血清、0.25%trypsin-EDTA.HBSS和DMEM购自Gibco;青、链霉素购自Sigma;碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)购自R&D;碘化丙唆(propidiumiodide,PI)购自上海生工公司。

2.2主要试剂驴血清购自JacksonImmunoResearch;牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)购自CellSignalingTechnology;glycine、L-lysine和TritonX-100购自Sigma;PBS购自福州迈新生物技术有限公司；RNeasyMiniKit购自QIAGEN;PowerSYBR®GreenPCRMasterMix购自LifeTechnologies;逆转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；8-筑基乙醇和莱普霉素BdeptomycinB,LMB)购自碧云天公司；多聚甲醛购自上海凌峰化学试剂有限公司;Opti-MEM和Lipofectamine3000购自Invitrogen;点突变试剂盒购自天根生化科技有限公司。

2.3实验仪器二氧化碳细胞培养箱和AutomatedCellCounter(Invitrogen);P-97拉针仪(SUTTER);ElectroSquarePorator电击仪(BTX);HM505E冰冻切片机(MICROM)；激光共聚焦扫描显微镜(ZeissLSM710);PCR扩增仪(Bio-Rad)o

3主要方法

3.1细胞培养和质粒转染N2a细胞培养在含有10%胎牛血清和1%青、链霉素的DMEM中。细胞置于5%CO?培养箱中372培养。利用小鼠大脑cDNA文库通过PCR扩增，得到全长Foxpl。Foxpl的上游引物序列为5，-ATGCAAGAATCTGGGTCTGAGAC-3',下游引物序列为5'-GGTTCACTCCATGTCCT-CATTTACTG-3，。通过EcoR1和MtI酶切位点将基因克隆到pCAGEN的载体上，得到Foxpl-pCAGENo通过PCR将V5(GKPIPNPLLGLDST)标签克隆到Foxpl-pCAGENN端，得到V5-Foxpl-pCAGEN。在V5-Foxpl-pCAGEN上采用点突变试剂盒，引入Y435X点突变，得到V5-Foxpl-Y435X-pCAGEN。使用Lipofectamine3000将构建的质粒转染到N2a细胞中。

3.2Westernblot实验使用含有蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，BCA法检测各蛋白浓度，加入loadingbuffer煮5min后置于-20t储存。按照Westernblot步骤对蛋白样品电泳及电转,5%脱脂牛奶封闭1h,加入I抗[抗V5抗体(1：5000,Abeam)和抗a-tubulin抗体(1：5000,Sigma)]4T孵育过夜,加入II抗室温孵育1h,最后采用Odyssey红外荧光扫描成像系统分析。条带经扫描后，采用Image-ProPlus6.0软件(MediaCybernetics)进行灰度值计算分析。

3.3子宫内胚胎基因转染用子宫内胚胎基因转染技术将质粒转染到大脑皮质前体细胞中。按剂量对孕鼠进行腹腔麻醉，腹部用70%酒精消毒。沿腹中线从上至下切开3~5cm,打开孕鼠腹腔，轻轻取出子宫。挑选其中一个胚胎的头部，微玻针吸取电转质粒(4g/L,约0.5jjlL)经孕鼠腹腔刺入胚胎侧脑室；指示质粒(pCAGGS-GFP):目的质粒(pCAGEN或pCAGEN-V5-Y435X)=l：5(体积比)。用电极紧夹吹

入质粒后的胎鼠头部，质粒侧贴放正极，开始电击:电压38V,间隔50ms,共5个pulse。电击操作完后把子宫放回腹腔，医用缝合线逐层缝合腹膜及皮肤。用加热光源照射孕鼠供暖促进苏醒,孕鼠苏醒后送回清洁动物房饲养。

3.4细胞免疫荧光4%多聚甲醛室温固定N2a细胞或原代神经元15min,0.3%TritonX-100破膜5min,lxPBS洗2遍后加入适量的封闭液；室温孵育1h;加入I抗[抗V5抗体和抗核纤层蛋白B(laminB)抗体,1：500,Abeam],37Y孵育1h;IxPBS洗3遍后，加入II抗,37°C孵育lh。免疫荧光图片通过ZeissLSM710共聚焦显微镜获得。

3.5组织免疫荧光小鼠用4%多聚甲醛灌注固定。取出相应时间的小鼠大脑，用4龙预冷的4%多聚甲醛后固定4h至过夜(胚胎小鼠大脑固定4h,成年小鼠大脑固定过夜)。标本加入30%蔗糖溶液脱水，用OCT包埋。使用HM505E冰冻切片机制作冰冻切片(厚度M^m)。免疫染色:大脑切片，加I抗[抗V5抗体(1：500,Abeam)、抗laminB抗体(1：500,Abeam)、抗GFP抗体(1：1000,NovusBiologicals)和抗GM130抗体(l：300,Sigma)]4cC过夜；加R抗，室温孵育2h。免疫荧光图片通过ZeissLSM710共聚焦显微镜获得。皮层分区通过DAPI染色确定。所有实验至少重复3次以上。

4统计学处理

数据均釆用均数士标准差(mean±SD)表示。显著性差异分析用SPSS11.5软件进行t检验。以尸＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1FoxplY435X突变体在N2a细胞中的表达及定位

Y439X是一个人类FOXP1的无义突变体，可以在亮氨酸拉链区和FOXDNA结合结构域之间截短,产生一个突变蛋白。为了探索FOXP1突变体Y439X的功能，我们首先克隆了小鼠的全长Foxpl及其突变体Y435X,分别连接V5的标签。随后，在N2a细胞中检测Y435X的蛋白表达水平。Westernblot结果显示,V5-Y435X产生一个大约56kD的截短蛋白，与全长Foxpl相比，表达量明显增加(图1A)。小鼠Foxpl与人类FOXP1相似，拥有2个保守的核定位信号，以及一个潜在的核输出信号。Y435X突变所截短的蛋白位于第1个核定位信号后，丢失了全部的FOX区域和第2个核定位信号。为了确定突变体的亚细胞定位,我们在N2A细胞中利用免疫荧光技术检测V5-Y435X的表达。野生型Foxpl连接V5的标签，蛋白表达定位在细胞核；而突变体Y435X连接V5的标签，表现出异常的亚细胞定位，在胞质中呈弥散性分布，并形成聚集物(图1B)。这一发现与之前人类FOXP1Y439X突变体无法定位核中，而在胞质产生聚集体的结果相一致⑶。以上结果说明Y435X突变后产生一个截短蛋白，并使得其亚细胞定位发生改变，这与其中一个核定位信号丢失有关。

2FoxplY435X突变体在N2a细胞中诱发核膜皱缩

蛋白质聚集与许多病理条件有关，包括几种神经退行性疾病如阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病，以及II型糖尿病或传染性海绵状脑病。神经退行性疾病患者神经元中形成蛋白聚集体,可能会干扰细胞内高度保守的核质转运(nucleo-cytoplasmictransport,NCT)功能如，这一机制可以保证核酸和蛋白运输顺利通过核膜，是神经元最基础的信号通

路。核膜主要在维持核形态、锚定核孔复合物、染色体组织及启动DNA损失修复中发挥作用㈤。研究显示核膜及核孔的损伤与神经退行性疾病以及生理状态下神经元衰老有关闡。本实验在N2a细胞中瞬时转染V5-Y435X或V5-Foxpl,利用laminB抗体标记核膜上的核纤层蛋白，分析Y435X突变形成的聚集体是否会导致核膜形态异常。免疫荧光结果显示，对照V5-Foxpl转染组的细胞核膜完整，呈现圆润的环形结构；而表达Y435X突变体的细胞核膜发生了皱缩，呈多褶皱状，见图2。

oflaminBwasperformed.NucleiwerestainedwithDAPI(blue).Thescalebar=5pim.图2FoxplY435X突变体在N2a细胞内诱发核膜皱缩Foxpl含有一个潜在的核输出信号，可以通过核输出的选择性抑制剂使其滞留在核中口"。Y435X突变体可能由于蛋白错误折叠而暴露其核输岀信号，使得聚集体在胞质中易位表达。为了证实Y435X对NCT的影响，我们在转染V5-Y435X的N2a细胞中加入核输出阻断剂LMB,利用免疫荧光技术检测Y435X突变体的表达。结果显示，加入对照溶剂的转染组中.Y435X突变体主要在胞质中表达并形成聚集体;而当加入LMB后,Y435X突变体在胞核和胞质中均表达，见图3。以上结果说明,Y435X聚集体可能通过核膜损伤而影响NCT,最终诱发ASD的发生。

3FoxplY435X突变体在原代皮质神经元中的表达和定位

为了确认FoxplY435X突变体的在体表达情况,我们将pCAGEN-V5-Y435X或pCAGEN与指示质粒pCAGGS-GFP混合，再通过胚胎基因转染的方法，共同导入E14.5小鼠侧脑室。在E16.5时，分离转染阳性的大脑皮质，制备成单细胞悬液，在24孔板中培养24h。待细胞贴壁后，加入V5抗体，利用免疫荧光检测Y435X的表达情况。如图4所示,Y435X突变体不仅在神经元胞体的胞质中呈聚集体样表达，还存在于分化的突起上。这表明FoxplY435X突变体可能对神经元的形态发生产生一定的影响。

4FoxplY435X突变体干扰皮质神经元在大脑皮质的最终定位

神经元迁移到特定位置后,皮质分层建立，这一过程受多种胞外和胞内信号调节的肌动蛋白及微管骨架控制3〕。为了明确FoxplY435X突变体对皮质分层的影响，我们釆用胚胎基因转染将Y435X质粒DNA转染到E14.5的胚胎小鼠皮质前体细胞中。P2时取脑，切片观察GFP阳性神经元是否存在滞留（分层异常）。在正常情况下P2的皮质神经元已完成了径向迁移，对照组的GFP阳性神经元大多数已经迁移至H-IV层，只有少量的细胞还存在V~VI层和白质；转染Y435X后，只有不足60%的细胞位于D-IV层,而大量GFP阳性神经元异常定位于V~VI层和白质，见图5。以上结果表明，虽然Y435X突变对早期神经元径向迁移无影响，但是对神经元的最终定位——皮质分层存在明显的干扰作用。

5FoxplY435X突变体对皮质分层的影响具有长期效应

为了确定Y435X突变诱发的神经元异位是否具有长期效应，我们将E14.5电转的小鼠在岀生后P8和P16时取脑，切片分析GFP阳性神经元在皮质各层的分布。与上述P2时期结果相似，P8和P16时期对照组的GFP阳性细胞大多存在第n~iv层，而表达V5-Y435X的细胞在H-IV层中的比例显著减少，V~VI层中的异位神经元明显增加，见图6。这些数据表明.Y435X突变对皮质中神经元的定位和分层具有长期效应。

6FoxplY435X突变体对深层异位神经元顶树突方向的影响大部分上皮层锥体神经元在P2时完成迁移,到达最终位置的神经元形成树突和轴突，再与其他神经元一起发育岀有功能的突触。锥体神经元的树突又可以进一步细分为朝向软脑膜表面生长的顶树突，以及从胞体发出的具有多个分支的基树突逐"J。树突作为神经元的主要结构，可以接收来自其他神经元和胶质细胞的信息输入。因此,树突的形态是神经系统功能正常发挥的决定性因素。在前期实验中我们观察到,P2时期滞留在第V~M层的细胞形态存在异常，其顶树突方向似乎并未朝向软脑膜生长(图7A)。为了确定这一现象,我们通过胚胎基因转染将Y435X质粒DNA导入E14.5的胚胎小鼠大脑皮质前体细胞中。在P2取脑，切片，利用GM130抗体(标记高尔基复合体基质)进行免疫荧光染色，分析Y435X表达对异位神经元顶树突方向的影响。通常情况下高尔基复合体位于朝向软脑膜表面生长的顶树突中伽。滞留在第V~VI层的神经元只有(38.37±2.57)%的顶树突朝向软脑膜生长，而方向异常的滞留神经元比例可以高达(64.57±2.70)%,见图7B、C。以上结果说明,在大脑皮质发育早期表达Y435X突变体将影响皮质神经元顶树突的生长方向，使其极性改变。

讨论

为了探索人类FOXP1Y439X突变导致ASD发生的细胞机制，我们首先克隆了小鼠Foxp1Y435X突变体(根据蛋白序列比对，小鼠Y435X等同于人类Y439X),并在N2a细胞及原代培养的皮质神经元中利用免疫荧光检测V5-Y435X的表达和定位。结果与之前文献报道的结果相同:FoxplY435X突变体以聚集体的形式，在N2a细胞和小鼠皮质神经元胞质中表达，这可能与一个核定位信号的丢失有关。

正常的NCT是保证转录因子入核的基本过程。核孔蛋白复合物(nuclearporecomplex,NPC)是完成NCT的必要且保守的动态结构。分子量在40kD、直径在5nm以下的小分子，可以相对自由地扩散通过NPCO相比之下，分子量相对较大的蛋白，则需要依靠高度精密调节的NCT机制㈣。即使NPC功能及完整性的微小损伤也将会逐渐积累，导致核蛋白在胞质中堆积,最终导致细胞死亡。蛋白聚集体是神经退行性疾病的一个独特的病理学特点，包括肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和亨廷顿病在内的多个神经退行性疾病均与NCT信号通路缺陷有关s如。细胞骨架异常、蛋白聚集体形成和氧化损伤都是神经退行性疾病的共同特征，均能诱导NCT的缺陷，例如核膜上NPC的缺失、蛋白错误定位以及核纤层异常等。在培养N2a细胞时我们发现，转染Y435X后48h,有很多细胞崩解，随后碎片化死亡。为了证实Y435X是否与NCT异常导致的细胞死亡有关，我们利用免疫荧光染色观察突变体对N2a细胞核膜形态的影响，以及Y435X的表达是否与NCT异常有关。结果发现:转染Y435X突变体后,细胞中核膜出现皱缩，而当加入LMB后,Y435X在核和胞质均有表达。因此推测Y435X可能通过影响NCT,进而导致ASD疾病的发生。后续我们还将利用多种方法，分析和检测究竟哪些NPCs受到突变体的影响而发生定位的改变，借此进一步证实Y435X与NCT之间的相互关系。

完成细胞内初步功能分析后，我们又进行了突变体Y435X在大脑皮质神经元发育中作用的在体研究。通过子宫内胚胎基因转染技术，在E14.5胚胎小鼠大脑皮质中过表达Y435X。P2时结果表明，Y435X在神经元定位中发挥作用，部分神经元异位出现在第V-VI层。进一步对神经元形态的分析说明,异位神经元的顶树突并未朝向软脑膜表面，而是呈现出不规则的朝向。此外，定位改变还可以持续存在，直到P16,说明突变体的影响并不是短暂可以修复的，而是具有长期性的。神经元迁移、定位及形态发生是神经回路组装的关键调控过程。在自闭症患者的脑中，脑室周围神经元异常堆积（室周异位）经常高比例出现E。后续可以釆用离体脑片膜片钳，评估异位神经元的电生理功能。神经元异位的机制相对复杂，推测可能由于Y435X诱发神经细胞产生大量聚集体，诱发NCT异常，进而影响神经元最终定位和形态发生，这可能是临床上自闭症相关FOXP1Y439X突变症状出现的根本原因。对自闭症相关Foxpl无义突变R521X（人类R525X）的研究表明，在胚胎发育早期过表达R521X可以诱导神经细胞（括皮质神经元）发生自噬而非无义突变介导的mRNA降解，并干扰神经元的径向迁移⑶。因此，不同的ASD临床表型,存在不同的致病机制，在未来的药物靶点筛选时,需要釆取不同的治疗策略。

本课题使用过表达的方法对小鼠Foxpl突变体的功能进行研究，可以对基因敲除动物实验进行补充。传统基因敲除动物模型是假设杂合突变可以丧失一个等位基因，在体产生单倍体剂量不足的效应，目的在于重现人类基因突变产生的表型。但在过表达Y435X的神经元中，异常现象不可能仅由杂合缺失引起，而且有可能是由突变蛋白造成。Foxpl的蛋白高度保守，因此推测小鼠Y435X的人类同系物——FOXP1Y439X突变体在人类大脑中可能会产生类似的作用，并且可以与FOXPI杂合缺失作用相叠加，加剧神经元的发育障碍，从而导致神经发育类疾病发生。

[参考文献]

[1]MattilaML,KielinenM,LinnaSL,etal.AutismspectrumdisordersaccordingtoDSM-IV-TRandcomparisonwithDSM-5draftcriteria:anepidemiologicalstudy[j].JAmAcadChildAdolescPsychiatry,2011,50(6):583592.ell.

[2]KimYS,LeventhalBL,KohYJ,etal.Prevalenceofautismspectrumdisordersinatotalpopulationsample[j].AmJPsychiatry,2011,168(9)：904-912.

[3]俸笛，陈保林，肖露，等.妊娠期脂多糖暴露通过激活子代小胶质细胞诱导大鼠孤独症样行为[J].中国病理生理杂志，2020,36(5):837-846.