不明原因智力低下和孤独症谱系障碍儿童脆性X综合征的筛查结果分析

雷洁  龙敏  肖砚微  林晓文  张静

（深圳市南山区妇幼保健院检验科，广东深圳518067）

【摘要】目的不明原因智力低下和孤独症谱系障碍儿童脆性X综合征FMR1基因筛查结果分析。方法选择不明原因智力低下和孤独症谱系障碍患儿35例，采用常规G显带染色体核型分析患儿染色体畸变情况,CNV-seq技术分析染色体拷贝数变异，PCR结合毛细管电泳法分析FMRI基因5,非编码区的CGG重复序列数目。结果35例患儿中核型异常者2例，CNVs异常者4例，1例患儿的FMR1基因5,非编码区的CGG重复序列数目大于200,为全突变型脆性X综合征，此患儿临床表现为语言发育滞后，智力低下等，患儿母亲为前突变携带者。结论对智力低下和孤独症谱系障碍人群进行脆性X综合征的基因筛查分析，是对其他遗传学检测方法的重要补充，对于明确发病频率，致病原因和后续的遗传咨询、产前诊断具有重要的参考应用价值。

【关键词】智力低下；孤独症谱系障碍；脆性X综合征

中图分类号：R596.1文献标识码：A文章编号：1000-744X(2021)1-0003-04

基金项目：深圳市南山区卫生局（编号：南科研卫2018063号）,南山区医学重点学科建设资助。

前言

脆性X综合征（FXS）是常见的遗传性智力低下疾病之一「门，也是引起孤独症谱系障碍最主要的单基因遗传疾病⑵o超过99%的FXS是由于Xq27.3的脆性X智力低下基因1（FMRI）5,端非

三核昔酸重复序列的异常扩增及CpG岛的异常甲基化引起脆性X智力低下蛋白（FMRP）的表达下降或缺失所导致3勺，目前尚无有效的治疗方法。因此，开展广泛的筛查工作，对携带者和患者予以必要的遗传咨询和产前诊断以降低患儿的出生率是防治此病的关键。本研究中，我们对不明原因智力低下和孤独症谱系障碍儿童脆性X综合征FMRI基因筛查情况及表型进行分析。

1资料与方法

1.1一般资料选取2018年11月至2019年11月就诊于我院的不明原因智力低下和孤独谱系障碍患儿35例。其中男31例，女4例；年龄1〜10岁，平均4.7岁。

1.2方法

1.2.1染色体核型分析采用常规外周血淋巴细胞培养法，培养68—72h,收获前1h用秋水仙素处理，制片，进行G显带核型分析，每例随机计数30个分裂相，嵌合体病例计数100个分裂相。分析3〜5个核型，异常者加倍计数与分析并根据人类细胞遗传学国际命名体制命名(ISCN2016)。

1.2.2全基因组拷贝数变异检测(CNV-seq)收集脆性X综合征筛查患者外周血，结合低通量测序基因组拷贝数分析(CNV-seq)和生物信息学分析技术，利用BGISEQ500测序平台进行全基因组范围内染色体拷贝数异常检测。具体包括基因组DNA的提取、酶切、连接接头、PCR富集、纯化、获得DNA文库、测序和分析等步骤。将测序读长与已知人类参考基因组进行匹配比对，统计完全匹配的读长数,计算样本间的Log,比值，并采用特定算法判读待测样本的染色体情况。针对大小为100kb以上的片段进行致病性分析。CNVs的临床意义参照最新版美国医学遗传学与基因组学会(ACMG)遗传变异分类标准与指南「可通过检索DECIPHER,DGV.OMIM数据库，并结合表型及CNV-seq比对结果综合判定。

1.2.3脆性X综合征筛查实验采集患者外周血2mL,利用外周血基因组提取试剂盒提取基因组DNA。采用阅微基因脆性X综合征检测试剂盒、PCR仪及基因分析仪(ABI3500DXGeneticAnalyzer),利用荧光定量PCR扩增结合毛细管电泳检测法对FMR1基因5,端非编码区CGG重复次数进行检测。CGG重复数量小于45次为正常型，45〜54次为中间型,55-200次为前突变型，大于200次为全突变型。

1.3统计学方法采用SPSS17.0软件进行数据分析,计数资料的比较采用f检验，以PV0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1临床资料及结果在35例患儿中，智力低下者14例，占40%；孤独系谱障碍7例，占20%；另外还包括语言发育迟缓等临床表型。35例患儿中31例外周血染色体核型正常，染色体多态性2例，另外2例染色体核型异常患儿分别为47,XY,+mar和46,XY,inv(8)(pll.2q21.2)sCNV分析结果显示31例正常，4例异常患儿分别为del(20)(ql3.13)chr20：g.49317261_49608453del,dup(18pll.Ipll.32)chrl8：g.67662_150410898X4,dup(22)(qll.23)chr22：g.23674079_25063169dup以及dup(16)(pl3.3)chrl6：g.59995_156550dupo脆性X基因筛查结果显示.FMR1基因(CGG)n重复数小于40的有32例，占91.43%；(CGG)n重复数40〜45之间的有2例，占5.71%；此外有1例患者FMR1基因(CGG)n重复数大于200,占2.86%。见表1。表135例不明原因智力低下及孤独系谱障碍患儿核型.CNVs及脆性X基因筛查结果分析(.r±.s)

2.2脆性X综合征阳性病例表型及家系分析35例患儿中检出1例患者的FMR1基因（CGG）n重复数大于200,患者男性,受检时2岁10个月，临床表现语言发育迟滞，只会叫“妈妈”，大耳，阴茎较同龄儿童大，另身高明显高于同龄儿童。患儿母亲表现为长脸，身高较高,余无明显异常，父亲无明显异常表征，对患儿父母进行脆性X综合征筛查发现其母亲FMR1基因（CGG）。重复数为128,为前突变型，父亲正常。同时,患儿的CNV测试未检测出有临床意义的染色体拷贝数异常。见图1。图1脆性X综合征阳性病例的FMR1基因（CGG）.重复数和CNVs分析

3讨论

脆性X综合征是仅次于唐氏综合征的引起智力低下的疾病由于X染色体连锁遗传特征，男性患病率约为1/7000,明显高于女性患病率1/11000口。本研究中的筛査对象也以男性患者为主。同时，脆性X综合征常表现孤独症样的症状，如社会交往能力差、非言语及言语交流障碍以及重复的机械刻板行为，是孤独症谱系障碍最常见的共患病甘。脆性X综合征在不同人群中的患病率有所差异,在高加索男性智力低下人群中的发病率为2.6%〜&7%3〕，亚洲人群中台湾地区发病率约为1.9%™,日本男性智力低下患者中脆性X综合征的发生率约为0.8%〜2.4%口口。本研究中通过检测发现1例患儿的FMR1基因（CGG）n重复数大于200,为全突变型，占2.86%,与前述研究发病率基本符合。而我国其它学者报道的脆性X综合征在智力低下患儿中的发病率有较大差异，如N.Zhong等「辺在1127例智力低下患者中发现脆性X综合征的发病率为2.8%,与本研究相仿;李薇等「可对2300例智力低下患者筛查发现90例脆性X综合征，占3.9%,略高于本研究;而赵舊等口句的研究则在3844例智力低下患者中筛查发现了343例脆性X综合征，占8.9%。由此可见，针对脆性X综合征开展大规模的筛查工作,对于明确其在我国智力低下人群中准确的发病率具有重要意义。

针对脆性X综合征的筛查主要依赖于临床特征和实验室检查。临床特征主要包括智力低下及相关家族史、大耳、巨睾症、孤独症样症状等「侦，本研究中发现的脆性X综合征患儿呈现典型的语言发育滞后，智力低下，阴茎发育异常等临床症状，对于临床筛査具有重要的提示价值。然而，由于个体表型差异较大，表型复杂，且不易与其它导致智力低下和孤独症样症状相区别。携带前突变基因的女性有50%的概率将突变传递给下一代,在子代中转变成全突变的概率与母亲前突变(CGG)“重复次数的大小有关，(CGG)n重复达100次以上时转变成全突变的概率接近100%,该患儿母亲FMR1基因(CGG)„重复数为128,再生育男孩患病风险接近100%。目前，脆性X综合征FMR1基因的分子遗传学检测是确诊的唯一手段，也是进行产前诊断的必备技术。CMA.CNV-seq等染色体拷贝数检测技术和FMR1基因检测已被推荐为不明原因智力低下遗传学病因诊断的一线筛查手段™。值得关注的是，由于脆性X综合征的检测涉及FMR1基因非编码区CGG重复数的检测，目前常用分子遗传方法如二代测序,CMA,CNV-seq等均不能检出脆性X综合征的动态突变。因此，针对FMR1基因动态突变的检测是对不明原因智力低下及孤独症谱系障碍病因学分析重要的补充分析方法。依据FMR1基因突变的特点，现行已建立了多种有效的实验室诊断方法,诸如Southern杂交、甲基化特异性PCR、免疫细胞化学方法等口门。Southern杂交法是主要确诊方法，但对CGG重复数较少的携带者或嵌合体可能漏诊,酶解不完全时则可能误诊。而且该法费用昂贵，费时费力，需要大量DNA,有放射性危害，不适合基层大范围筛查。常规PCR检测可诊断正常和CGG重复数较少的携带者，但无法诊断CGG重复数较多的携带者和全突变者。本研究中采用的基于三引物荧光定量PCR结合毛细管电泳技术口对,不仅具有灵敏度高、可重复性强的特征，更重要的是可准确计算出CGG重复数，并且对女性杂合子携带者具有良好的筛查效果(如本研究表1中筛查检出2例女性患者的CGG重复数存在差异)，可快速准确区分不同基因型人群,对脆性X综合征的筛查及确诊实验的开展具有良好的优势。

总结

综上所述，针对智力低下、孤独症等人群开展脆性X综合征的临床和实验室筛査工作对于提早发现、尽早干预，以及对患儿父母进行必要的遗传咨询和产前诊断，避免智力低下患儿的出生具有重要意义。

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