【针灸论著】针刺后海穴对自闭症大鼠海马NRXN-1、NLGN-3蛋白表达的影响

张学君，洪霖，洪钰竺，黄倩茹，吴强

（福建中医药大学，福州  350122）

摘要：目的：观察针刺后海穴对自闭症大鼠海马NRXN-1和NLGN-3蛋白表达的影响。方法：24只自闭症大鼠，随机分为模型组、针刺后海穴组、针刺非穴组，每组8只，另取8只大鼠为空白组。针刺后海穴组选取后海穴，直刺0.3寸，行提插手法，160-200次/min，连续针刺30d。干预结束次日，用水迷宫检测大鼠的学习记忆能力；用免疫组织化学技术检测大鼠海马NRXN-1和NLGN-3蛋白表达情况。结果：与模型组比较，针刺后海组平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.05），穿越平台次数明显增加（P<0.05），NRXN-1和NLGN-3蛋白阳性细胞灰度值明显降低（P<0.05）。结论：针刺后海穴可能通过调控海马NRXN-1和NLGN-3蛋白的表达来改善自闭症大鼠的学习记忆能力。

关键词：针刺；后海穴；自闭症；NRXN-1；NLGN-3

基金资助：国家自然科学基金资助项目（No.81202764），福建省教育厅资助项目（No.JK2012022）

通讯作者：吴强，福建省福州市闽侯上街邱阳路1号福建中医药大学针灸学院，邮编：350122，电话：0591-22861866E-mail：463813345@qq.com

本课题组前期研究观察到针刺后海穴对自闭症大鼠学习记忆能力具有改善作用[1]。本研究拟通过观察针刺后海穴对自闭症大鼠海马神经黏附因子（neurexin-1，NRXN-1）和（neuroligin-3，NLGN-3）蛋白表达的影响，探讨针刺后海穴是否通过调控NRXN-1和NLGN-3蛋白对自闭症大鼠学习记忆能力产生影响。

材料与方法

1. 动物、选模及分组  20只清洁级健康成年Wistar大鼠，雌雄各半，体质量雌性200-250g，雄性300-350g，由上海斯莱克实验动物公司提供（合格证号：2007000536000），依托福建中医药大学实验动物中心按照SPF级喂养。大鼠置于动物中心饲养数日，使之适应环境。自闭症模型制备参照文献[2]的方法：雌、雄大鼠两两配对，合笼过夜，以次日早晨检查到阴栓的雌鼠记为胚胎1d（embryofoday，E1），并单独分笼饲养。用随机数字表法将受孕母鼠随机分成两组，其中1组8只，在E12.5时注射600mg/kg的丙戊酸钠（VPA，VPA粉末用0.85%氯化钠溶液配成250mg/m L溶液），选取24只自闭症大鼠（经发育行为学鉴定造模成功，为VPA组），并按照随机数字表将分为针刺后海穴组8只、针刺非穴组8只、模型组8只，另1组受孕母鼠2只，所生下的8只大鼠为空白对照组。

2. 主要实验仪器及试剂  本课题所使用主要仪器：Morris水迷宫系统SMG-2型（中国医学科学院药物研究所）；BX51T-PHD-J11显微镜（日本奥林巴斯有限公司）；VPA（美国Sigma公司，浓度：250mg/m L）；多聚赖氨酸（美国Sigma公司，P8920）、一抗NLGN-3（美国Santa公司，Cruz SC-50395）、sp-9001（美国Santa公司，invitrogensp-9001）、D-AB（北京中杉公司，zli-9032）由福建贝尔曼试剂公司提供。

3. 子代鼠发育情况检测

3.1 方向趋向性机能检测  大鼠出生后（postnatal day，PN）7-10d时，各组大鼠按头朝下放置在25°的光滑倾斜平面上，记录大鼠转动180°的情况所需时间。3.2 伤害性知觉测试  大鼠长到PN9、PN11、PN13和PN15时，调节热板温度（55.0±0.5）℃。记录从放入大鼠至鼠舔后足所经历的时间，此时间即为痛阈值。

4. 针刺干预

4.1 选穴  后海穴定位参照《实验针灸学》[3]，选取肛门和尾骨之间的凹陷处。非穴定位为右侧髂后上棘上2cm，脊柱 旁开5cm[4]。

4.2 干预方法  针刺干预从自闭症大鼠出生后第24d开

始。针刺后海组选后海穴，针刺非穴组选非穴，针刺组用华佗牌30号0.5寸毫针直刺0.3寸，行提插手法，频率约为160- 200次/min，持续1min。每日针刺1次，连续干预30d。空白组与模型组仅行与针刺组同样的抓取动作，余同前。

4.3 Morris水迷宫学习记忆能力测试  Morris水迷宫实验步骤如下。

4.3.1 定位航行实验：干预后次日，各组大鼠从第1个象限开始，按逆时针方向，从各象限边缘的中点位置面向池壁逐一单独放入水中。观察并记录各实验鼠在一定时间内（定为60s）找到平台的时间（即平均逃避潜伏期）。

4.3.2 空间探索实验：定位航行实验后撤除平台，然后任选1个入水点将实验鼠面向池壁放入水中，由摄像及电脑路径软件系统自动记录实验鼠60s内穿越目标平台的次数。

5. 免疫组织化学技术检测NRXN-1、NLGN-3蛋白阳性细胞灰度值5.1 灌注取脑  水迷宫测试后次日，将实验鼠用10%水合氯醛（0.36m L/100g）麻醉，用手术剪将麻醉后的实验鼠胸腔剪开，将心脏充分暴露于视线，用装有50m L 0.85%氯化钠溶液的注射器插入心尖部1-2mm，用小号手术剪在右心耳处剪一开口，并快速将注射器内的0.85%氯化钠溶液往心尖推注，直到右心耳开口处流出的液体的颜色变透明，并立刻更换4%多聚甲醛溶液缓慢推注实验鼠的右心耳，直到实验鼠尾巴完全僵直时，用钝性剪将实验鼠的颅骨分开，取出大脑。

5.2 样品制备（海马）及免疫组织化学检测  将取好的脑组织，按照《大鼠脑立体定位图谱》[5]，垂直于冠状面切取前囟3.14-6.3mm厚脑组织，可见到海马组织，并将脑组织用不同梯度浓度的酒精脱水、浸蜡、二甲苯梯度脱蜡。脱蜡后将脑组织块包埋，并把包埋好的脑组织石蜡切片，片厚约5μm，切片在0.01mol/L的柠檬酸缓冲液中（p H6.0）微波修复10min，切片在PBS中漂洗10min。通过0.5%的正常羊血清PBS孵育30min，与一抗孵育在4℃过夜。将切片用PBS液洗3遍，二抗孵育30min。用PBS冲洗切片，DAB显色，二甲苯透明、中性树脂封片、组织切片，贴于防脱片，50℃烘烤3h。在光镜为40×10倍视野下，观察染色的NRXN-1、NLGN-3阳性细胞情况，胞浆或胞核有棕色颗粒者为目的指标的阳性细胞。每张切片中随机采集5张海马区阳性细胞的高倍视野（视野的细胞总数>100），运用彩色病理图文系统分析，测量分析阳性细胞数及阳性细胞的灰度值，参照文献[6]方法。

6. 统计学方法  数据用x-±s表示，采用SPSS 18.0统计软件对实验数据进行分析；水迷宫数据和细胞阳性灰度值结果进行统计分析，采用多重比较的单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1. 发育情况比较  见表1。与空白组比较，VPA组各时间段的方向趋向性机能降低（P<0.05）。

表1  两组仔鼠不同日龄倾斜板试验测定结果（x-±s，n=8，s）

组别 PN7 PN8 PN9 PN10

空白组 151.23±6.04 121.16±3.00 86.96±8.31 53.10±4.13

VPA组 227.43±3.85*201.65±3.52*135.63±6.30*92.74±5.59

*注：与空白组比较，*P<0.05。

2.  伤害性知觉测试  见表2。与空白组比较，VPA组在PN9、PN11、PN13、PN15痛阈升高（P<0.05）。

表2  两组仔鼠不同日龄热板致痛试验结果（x-±s，n=8，s）

组别 PN9 PN11 PN13 PN15

空白组 33.91±2.78 20.81±2.00 14.59±1.78 11.21±0.45

VPA组 62.70±13.90*38.44±6.06*22.05±4.33*15.66±2.94

*注：与空白组同期比较，*P<0.05。

3. Morris水迷宫检测结果

3.1 各组平均逃避潜伏期结果比较  见表3。与空白组比较，模型组平均逃避潜伏期明显增加（P<0.05）；与模型组比较，针刺后海组的平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.05）；与针刺非穴组比较，针刺后海组的平均潜伏期明显缩短（P<0.05）。

表3  各组大鼠针刺干预后平均逃避潜伏期及穿越平台次数 （x-±s，n=8）

组别 平均逃避潜伏期（s） 穿越平台次数

空白组 11.59±0.42*2.25±0.71*

模型组 31.76±0.50 0.75±0.71

针刺后海组 12.03±0.51*△2.00±0.76*△

针刺非穴组 30.89±0.70 0.88±0.83

注：与模型组比较，*P＜0.05；与针刺非穴组比较，△P＜0.05。下表同。3.2 各组穿越平台次数结果比较  见表3。与空白组比较，模型组穿越平台次数明显减少（P<0.05）；与模型组比较，针刺后海组的穿越平台次数明显增多（P<0.05）；与针刺非穴组比较，针刺后海组的穿越平台次数增多（P<0.05）。

4. 蛋白指标免疫组化检测结果  见表4。与空白组比较，模型组海马NRXN-1、NLGN-3蛋白阳性细胞灰度值明显升高（P<0.05）；与模型组比较，针刺后海组海马NRXN-1、NLGN-3蛋白阳性细胞灰度值明显降低（P<0.05）；与针刺非穴组比较，针刺后海组海马NRXN-1、NLGN-3蛋白阳性细胞灰度值明显降低（P<0.05）。

表4  各组针刺干预后海马NRXN-1及NLGN-3蛋白阳性细胞 灰度值结果（x-±s，n=8）

组别 NRXN-1灰度值 NLGN-3灰度值

空白组 132.26±4.24*160.24±4.40*

模型组 160.27±12.34 179.17±4.16

针刺后海组 134.84±3.32*△166.38±6.29*△

针刺非穴组 149.36±8.07 176.49±4.05

讨论

1. 针刺后海穴治疗自闭症的中医理论基础  自闭症属于古代“五迟”的范畴，病位在脑。古人早已认识到脑与学习记忆的密切关系，王清任在《医林改错·脑髓论》中说：“灵机记忆不在心在脑”。脑作为人体生命活动的主宰，可控制人的思维、学习和记忆等功能。脑与督脉关系密切。《难经》曰∶“督脉起于下极之俞，并于脊里，即侠脊也。上至风府，入属于脑，即上项散头”。督脉是机体脏腑精微上输于脑的重要通路[7]，若督脉亏虚，脏腑精微无法上达于脑，从而造成脑髓空虚[8]，进而影响学习与记忆能力。督脉起于长强穴（动物身上该穴称为“后海”），该穴在临床应用广泛，笔者观察到：针刺长强穴可用于治疗智力低下[9]。

2. 子代大鼠发育情况分析  本课题结果提示自闭症大鼠

在青春前期（PN30前为青春前期）出现方向趋向性机能（PN7-10）、痛觉的敏感性（PN9、PN11、PN13、PN15）及超敏反应降低甚至消失等发育迟缓特征，反应出了自闭症仔鼠前庭功能障碍及调控注意力和信息处理能力的感觉运动机能受损。表明了自闭症仔鼠青春前期的方向感觉及运动机能等总体发育水平下降，与自闭症患者临床表现非常类似，可见妊娠早期接触VPA会对子代鼠青春前期产生长远和多方面的影响。

3. 分析与讨论  本课题研究结果表明自闭症大鼠学习记忆能力减弱与海马NRXN-1和NLGN-3蛋白的表达减少相关，该结果与Kolozsi E等[10]的研究报道一致；通过针刺后海穴可提高自闭症大鼠学习记忆能力，并增加自闭症大鼠海马区NRXN-1和NLGN-3蛋白的表达。分析其作用机制，神经元的正常功能和可塑性依赖于兴奋性和抑制性突触之间的平衡，突触兴奋/抑制的比例增加是造成孤独症的一个重要因素，且该平衡受到NRXN-1、NLGN-3的影响。NRXN-1和NLGN-3是分别位于突触前膜和突触后膜的跨膜蛋白（属于突触细胞黏附分子），NRXN-1是一类高度多态性的神经元表面蛋白，参与细胞识别和细胞黏附，可以介导细胞信号转导，且在突触发生和突触传递等过程中发挥重要作用；NLGN-3是位于神经元突触后膜并介导突触生成的一类细胞黏附分子，可以特异性介导兴奋性或抑制性突触形成。前期研究表明[11-12]针刺后海穴可以促进自闭症模型大鼠海马CA1区脑源性神经营养因子（BDNF）的分泌及PSD-95的表达。许雪梅等[13]认为PSD-95的表达可以使NLGN-3所诱导形成的抑制性前突触的数量和大小发生明显的下降，即当PSD-95与NLGN-3共同表达时，NLGN-3主要以兴奋性突触的作用为主。NRXN-1与NLGN-3均处于NRXN-NLGN-SHANK通路中，且为上下游蛋白关系，可相互影响。本课题研究结果表明，针刺后海穴可改善自闭症大鼠海马学习与记忆能力，可能与针刺后海穴可引起NRXN-NLGN-SHANK通路主要蛋白（NRXN-1与NLGN-3）变化[14]，从而促进BDNF的分泌，进而使BDNF介导的Trk B受体活化，活化后的Trk B发出信号，信号通过PI3K-Akt途径引导PSD-95聚集于突触后膜，促进抑制γ-氨基丁酸（即抑制性的前突触）和诱导谷氨酸能轴突（即兴奋性的前突触）的突触前分化，参与调控兴奋性和抑制性突触之间的平衡，从而影响自闭症模型大鼠大脑突触可塑性（突触可塑性和学习记忆密切相关），改善自闭症大鼠的学习记忆能力。

参  考  文  献

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