【针灸论著】针刺后海穴对自闭症模型大鼠大脑皮层M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白表达的影响

张学君，洪 霖，洪钰竺，吴 强

（福建中医药大学针灸学院 ，福建 福州 350122）

基金项目：国家自然科学基金资助课题（81202764），福建省科技厅资助课题（2012Y0045），福建省教育厅资助课题（JK2012022）

作者简介：张学君（1981—），男，讲师，主要从事针灸治疗小儿脑病的研究。

通讯作者：吴强（1960—），男，教授。 E-mail：wq2033@yahoo.com.cn

摘要： 目的 观察针刺后海穴对自闭症模型大鼠大脑皮层 M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白表达的影响。 方法 采用孕鼠腹腔注射丙戊酸钠（VPA）的方法建立自闭症大鼠模型，分为空白组、模型组、非穴组、针刺组，每组 6 只。 针刺组取后海穴，用 0.5 寸一次性针灸针直刺 0.3 寸，行平补平泻提插手法 1 min 后出针，10 天为 1 个疗程，共治疗 3 个疗程；非穴组选取大鼠右侧胁下固定非经非穴点，余操作同针刺组；空白组、模型组不予任何干预；应用免疫组化技术观察 4 组大鼠大脑皮层 M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白的表达。 结果 大鼠大脑皮层 M1 区：与空白组比较，模型组 PSD-95蛋白表达有显著性差异（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组 PSD-95 蛋白表达有显著性差异（P＜0.05）。海马 CA1 区：与空白组比较，模型组 PSD-95 蛋白表达有显著性差异（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组 PSD-95 蛋白表达有显著性差异（P＜0.05）。 结论 针刺后海穴可提高自闭症模型大鼠大脑皮层 M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白的表达。

关键词：自闭症；针刺；后海穴；PSD-95 蛋白

中图分类号：R245.6 

文献标志码：A 

文章编号：1004-5627（2013）03-0015-03

针刺后海穴可改善自闭症模型大鼠学习和记忆能力［1］， 然而针刺通过何种途径产生作用尚不明确。 已有的研究认为学习和记忆与突触可塑性紧密相关， 针刺可通过调控突触可塑性的变化对学习和记忆能力的产生作用。 突触后致密物 95（postsynaptic density protein 95，PSD-95）可以与突触后谷氨酸受体，包括 N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）和 α-氨基羟甲基恶唑丙 酸 （α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）受体相互作用 ， 从而实现对突触后信号转导的调控。 研究表明，PSD-95 的表达一旦受到抑制， 可降低 NMDA 受体导致的兴奋性毒性； 而在 PSD-95 基因敲除小鼠身上发现：AMPA 受体介导的突触传递明显受到抑制 ［2］。 我们从 PSD-95 蛋白入手，观察针刺后海穴对自闭症模型大鼠大脑皮层 M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂 华佗牌一次性针灸毫针（ 苏州医疗用品厂有限公司 ， 规格 ：0.30 mm×15mm，批 号 ：120220）；HANS -200A 韩 式 电 针 仪 （ 南京济生医疗科技有限公 司 ）；BX51T-PHD-J11 显微镜、CMOS（日本奥林巴斯有限公司）； Image-ProPlus 多功能真彩色细胞图象分析管理系统 （美国Media Cybernetics 公司 ）；RM2015 切片机 （ 德国莱卡 公 司 ）；LDZ5-2 型 离 心 机 （ 北 京 离 心 机 厂 ）；MIR-153 型干燥箱 、MDF-382E 型低温冰箱 （日本三洋有限公司）；DSHZ-300 型恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）；YWY781B 型医用微波炉（浙江临安爱迪仪器厂）；VPA（美国 Sigma 公司，浓度：250mg ／ m L）；一抗 PSD-95（北京博奥森生物技术有限公司，BS-0179R）； 二抗 SP-9001 （美国 invitrogen公司）；DAB（北京中杉生物技术开发有限公司）。

1.2 实验动物及分组 成年 Wistar 大鼠 10 只 ，雌雄各半，福建中医药大学实验动物中心提供，雌性大鼠体质量 200～250 g，雄性大鼠体质量 300～350 g。 动物房温度控制在 18～26℃，光暗周期 12h。 大鼠在动物房内饲养 3 d，使之适应环境 。 参照王月华等［3］的方法，将雌雄各 1 只合笼过夜，次日早晨，如在雌鼠阴道内或所在笼内检测到阴栓，记为胚胎第 1 天（E1），单独置于 1 笼饲养。 于 E12.5注射 600 mg ／ kg 的 VPA， 产下的仔鼠经发育行为学测评显示造模成功即为自闭症模型大鼠。 选取18 只仔鼠进行实验， 分为模型组、 非穴组、 针刺组，每组 6 只，另取正常生产的仔鼠（不注射 VPA，余操作相同）6 只，作为空白组。

1.3 治疗

1.3.1 选穴 后海穴选择参照 《实验针灸学 》 中的定位方法［4］， 选择位于大鼠肛门和尾根部之间的凹陷处的后海穴。 非穴组取右侧胁下固定非经非穴点，作为对照刺激点。

1.3.2 针刺治疗 大鼠出生后 23 d，针刺组与非穴组用一次性不锈钢毫针，直刺后海穴和非穴 0.3寸，行平补平泻提插手法 1 min 后出针，连续治疗10 d 为 1 个疗程，疗程间隔 2 d，共 3 个疗程 。非穴组选取大鼠右侧胁下非经非穴点， 余操作同针刺组。 空白组、模型组在同等条件下饲养，不予任何干预。

1.4 指标检测 4 组大鼠完成水迷宫测试后 ， 立即麻醉，用手术刀切开胸腔，充分暴露心脏，以耳科剪剪开右心耳，用 5 m L 注射针头从左心室灌注生理盐水 250 m L 直至流出液清晰， 继续灌以 4℃多聚甲醛 500 m L，待大鼠出现四肢肌肉抽搐表示灌注成功。 快速断头，迅速用小镊子剥取脑组织，放入 4％多聚甲醛中固定 24 h 后，参照《大鼠脑立体定位图谱》［5］， 取额极后 2-5 mm 和 11-14 mm的脑片进行脱水、浸腊、包埋、切片、烤片、烘片、脱蜡等常规步骤。1.4.1 PSD-95 蛋白的免疫组化反应 ① 柠檬酸修复： 将切片采用 0.01 mol ／ L 磷酸盐缓冲液（p H7.2～7.4）漂洗 3 次 ，每次 3 min；② 用 0.02 mol ／ L柠檬酸修复液高压修复 3 min，自然冷却；③ 将玻片依次排列在湿盒中，滴加 3％H2O2， 室温下静置10 min； ④ 用 0.01 mol ／ LPBS 漂洗 3 次 ， 每次 3min；⑤ 按 1∶200 稀释 PSD-95 一抗 ， 将稀 释液滴加到切片上，移入 4℃ 冰箱孵育 12 h；⑥ 用 0.01mol ／ L PBS 漂洗 次 ， 每次 5 min； ⑦ 切片滴加SP-9001 （二抗 ），37℃孵育 2 h，0.01 mol ／ L PBS 漂洗 3 次。甩干，DAB 显色，苏木素复染，用中性树胶封片。

1.4.2 免疫组化评分 应用 BX51T-PHD-J11 显微图像采集与分析系统，每只大鼠大脑皮质和海马切片同一部位随机选取 5 个视野， 用 Image-ProPlus 多功能真彩色细胞图象分析管理系统进行图像分析。

1.5 统计学处理 数据用 x±s 表示 ，用 SPSS 17.0统计软件进行统计分析， 组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

实验结果见表 1、表 2。

3 讨 论

3.1 PSD-95 作为一种脚手架蛋白 ， 属于膜结合鸟苷酸激酶蛋白家族， 主要位于谷氨酸能突触的突触后密集区， 在谷氨酸受体的信号转导和整合过程中起着关键作用［6］。 在表达截短 PSD-95 突变体的小鼠上可以观察到：其与 NMDA 受体结合的能力丧失。 PSD-95 在功能上与突触可塑性的变化紧密相关， 用免疫组化实验技术可以检测到颗粒状的阳性标志物，如突触可塑性发生变化，其表达出来的颗粒状阳性标志物也将随之出现相应的变化。 本 实验通过免 疫组织化学 技术检测 并分 析PSD-95 蛋白颗粒免疫阳性物的表达 ， 可以分析PSD-95 表达的变化 ，间接反映地突触的可塑性变化［7］。3.2 本实验中， 模型组大鼠大脑皮层 M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白表达与空白组比较均有显著性差异（P＜0.05），表明模型组的皮层 M1 区和海马 CA1 区的 PSD-95 蛋白均较正常组低。 PSD-95 蛋白可决定突触的功能 ， 其表达的减少可导致自闭症模型大鼠大脑的突触受到影响， 从而使自闭症模型大鼠的学习与记忆发生障碍， 这与我们课题组之前的研究结果一致。 针刺组大鼠大脑皮层 M1 区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白表达与模型组比较，有显著性差异（P＜0.05），表明针刺后海

表 1 电针对模型大鼠皮层 M1 区 PSD-95蛋白的表达的影响（x±s）

组 别针刺组模型组非穴组空白组n6666免疫组化评分

5.67±0.812）1.33±0.521）4.00±1.265.33±1.03

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。分

表 2 电针对模型大鼠海马 CA1 区 PSD-95蛋白的表达的影响（x±s）

组 别针刺组模型组非穴组空白组n6666免疫组化评分

5.67±0.812）1.16±0.161）4.33±0.815.33±1.03

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05。

分穴可提高自闭症模型大鼠大脑皮层 M1 区和海马CA1 区的 PSD-95 蛋白的表达 。 既往研究表明 ，针刺后海穴可改善自闭症模型大鼠的学习和记忆能力， 其作用机制可能与针刺影响突触可塑性变化有关。 神经元的突触可塑性包括两大部分：功能可塑性和结构可塑性，与学习和记忆密切相关［8］。 针刺后海穴可促进自闭症模型大鼠脑源性神经营养因 子 （BDNF） 的 分 泌［9］。 Trk B 由 BDNF 介 导 ， 且PSD-95 和 Trk B 在体内相互作用 。 因此 ，BDNF -Trk B 通 路 的 活 化 使 PSD -95 由 细 胞 体 向 突 触 聚集， 这是突 触可塑性的 关键。 针刺后 海 穴 使 得BDNF 分泌增加 ， 从而使 BDNF 介导的 Trk B 受体活化，活化后的 Trk B 发出信号，通过 PI3K-Akt 途径通知 PSD-95 向突触募集，从而影响自闭症模型大鼠大脑的突触可塑性， 达到改善学习记忆能力的作用。 非穴刺激点对自闭症模型大鼠的皮层 M1区和海马 CA1 区 PSD-95 蛋白表达有所影响，虽然其处于非经非穴的位置， 但其隶属经络系统的范畴，究竟是非穴点刺激会产生效应，还是本研究样本量太少所致，还有待进一步观察。

参考文献：

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