Cell Genomics：孤独症中兴奋性神经元的蛋白质相互作用网络特征

自闭症(孤独症)谱系障碍(ASD)与大脑中丰富表达的基因有关，但我们尚不清楚这些基因是如何汇聚到特定细胞类型的网络中。近日，kevin C.Eggan和Kasper Lageu团队利用iPSC，在人类兴奋性神经元中的13个ASD相关基因中，构建了它们的蛋白质-蛋白质相互作用网络。文章在最新一期的Cell Genomics杂志上发表，名为“Protein interaction studies in human induced neurons indicate convergent biology underlying autism spectrum disorders”。

ASD包括社交互动、认知和行为方面相关的可遗传神经发育症状。最近的进展表明，ASD的不同表型反映了常见和罕见遗传变异的多基因贡献。然而，在神经发育过程中，ASD的相关基因是如何整合到高级通路和网络仍有待确定。

遗传和生化数据表明，与复杂疾病有关的基因通常会汇聚到蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络中。遗传和转录组数据表明，ASD-相关基因在大脑中的特定神经元和非神经元细胞群中有着丰富的表达，其中兴奋性神经元是最强的信号之一。因此，从iPSC中衍生出的神经元 (iNs)可以为研究ASD提供一种关键的体外神经元细胞模型。本文作者使用iPSC衍生出的兴奋性 iNs、相互作用蛋白质组学和计算方法，为ASD相关的基因构建脑细胞类型特定的PPI网络。

ASD相关基因和蛋白质在诱导神经元中表达

利用已有的24 个ASD相关基因为工作流程的起点，作者在iNs中生成ASD PPI 网络（图1A），本文将它们及其编码的蛋白质分别称为索引基因（index genes）和索引蛋白质（index proteins）。

作者在神经元分化的第0、3和6周期间通过细胞 RNA 测序测量了ASD相关指标基因的表达（图1C）。使用免疫印迹，作者评估了指标蛋白的表达。其中，只有13种蛋白质，作者在分化的第3周检测到。这些蛋白质在物种、神经元分化时间点或细胞类型中显示出不同的模式（图1E）。这些结果表明了，使用人类iNs对了解ASD相关的细胞类型特异性的生化作用的重要性。

图1.研究ASD相关基因和蛋白在人iNs中的表达及工作流程

ASD指标蛋白在诱导神经元中的相互作用蛋白质组学

对于具有IP（immunoprecipitation）活性抗体的13种指标蛋白，作者在分化第 4 周在iN中执行IP，然后进行质谱分析 (IP-MS)（图2A、2B）。

分析工作流程使用SHANK3的IP进行阐明。利用免疫印迹法， SHANK3在IP中的富集（图2A，左）得到证实，并通过 IP-MS 进行量化（图2B）。总的来说，SHANK3 在免疫印迹和 MS 结果中出现富集，结合重复之间的相关性，支持作者数据的可重复性和稳健性。

PPI网络由收敛的、新颖的和可重现的交互组成

作者合并了26个高质量的IP-MS数据集以生成组合的PPI网络（图2C）。该网络包含13种指标蛋白的1,021个相互作用因子，其中 >20% 与多个指标蛋白相关（图2D）。根据STAR方法，验证了71个测试交互中的65个（图2F，左）。在反向IP中，使用一组相互作用物作为诱饵，在23个具有诱饵富集的IP中检测到19个中的原始指标蛋白（图2F，右图）。

PPI网络概括了人脑中发生的相互作用

42%的大脑交互被识别为iNs中的交互（图2G）。作者还描述了iN衍生PPI网络中相互作用蛋白的共表达模式（图2H）。来自脑匀浆的IP-MS数据和大脑共表达分析表明，作者捕获了在人脑复杂组织中发现的基因关系。

图2. 为iNs中的13个ASD指标蛋白生成组合PPI网络

PPI网络涉及ASD中的第2/3层皮质兴奋性神经元

为了评估PPI网络的组织特异性，作者计算其与GTEx组织特异性基因与基因组其余部分的重叠富集。该网络在CNS和其他几个组织类别中显示出显著的富集（图3A）。当重复大脑区域特异性基因时，该网络在额叶皮层最丰富（图3B）。该网络在多种神经元细胞类型中显示出显著富集（图3C）。第 2/3层兴奋性神经元作为唯一重要的细胞类型脱颖而出（图3D）。

综上所述，这些结果表明PPI网络捕获了ASD相关组织和细胞类型中的生化变化和通路，并特别暗示第2/3层兴奋性神经元是ASD中的关键细胞类型。

图3. ASD PPI 网络的组织和细胞类型富集

该网络丰富了与ASD和发育障碍相关的罕见变体

作者评估了组合的PPI网络和索引蛋白特异性子网络是否丰富了与ASD相关的基因，结果表明，五个网络在全局分析中达到显著性，只有组合网络在条件分析中具有显著性。作者还使用发育障碍 (DDs) 和精神分裂症 (SCZ) 和 gnomAD pLI 分数的外显子组测序数据进行了类似的富集分析（图4A）。

网络分析可以优先考虑来自遗传研究的其他ASD相关基因

由于PPI网络富集了与ASD相关的罕见变异，作者使用它来优先考虑，在外显子组测序研究中未达到严格统计显著性的ASD相关基因。作者生成了一个“社会曼哈顿图”以突出PPI外显子组测序数据中FDR≤0.25的索引基因和其他ASD相关基因（图4B）。

图4.ASD PPI 网络中的遗传富集

结论

到目前为止，很少有PPI研究利用神经元细胞模型，更不用说将人类遗传学作为指标基因选择的切入点。作者构建了一个由13种指标蛋白组成的PPI网络，这些蛋白由人类iPSC衍生的兴奋性神经元中的高置信度ASD相关基因编码。该网络包含许多新的相互作用，丰富了在ASD个体中观察到的遗传和转录扰动，并可用于揭示与ASD相关的神经元特异性生物学。该数据不仅能够研究个体ASD相关基因的机制，而且还为治疗干预或临床分层策略提供了信息。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100250