儿童孤独症候选基因研究进展

焦公凯1王伟勇1张志珺1

(1.南京医科大学附属脑科医院,210029)

摘要：儿童孤独症或称自闭症,是一种广泛的心理发育障碍,它影响到儿童的感知、语言、情感和社会交往等多种功能。越来越多的证据表明遗传因素在儿童孤独症病因中起着一定的作用,本文将对儿童孤独症的分子遗传学研究现状和进展作一综述。

关键词：儿童孤独症基因

儿童孤独症是一种严重的心理发育障碍性疾病,通常起病于3岁之前,男女比率为4:1,主要表现为不同程度的社会交往能力缺陷、言语交流障碍、刻板重复行为方式及兴趣狭窄等。最近的流行学调查表明,儿童孤独症发病率为1/1000～1/2500[1]。过去20多年的研究表明遗传因素在其发生中起一定作用。家系研究发现,先证者的同胞中儿童孤独症的发病率约为大众人群的45倍[2]。双生子研究显示,单卵双生子同病率为60%～92%,而双卵双生子同病率为仅0%～10%[3]。近年来,研究者对儿童孤独症的多个候选基因进行了探讨,本文就此领域的研究做一综述。

1 儿童孤独症与5-HTT基因的关系

5-HT是一种重要的神经递质,研究表明5-HT与包括精神分裂症、抑郁症、焦虑症、强迫症、孤独症及物质滥用在内的一系列精神障碍有关[4],并参与了情绪、睡眠和食欲等一系列行为反应的调节。约1/3的孤独症患者及其一级亲属中全血或血小板5-HT水平升高,提示高血清素(5-HT)可能是孤独症的一个生化易感性标记[5]。

5-HT转运体(5-HTT)在5-HT释放后再摄取中起重要作用,具有调节和运输5-HT功能。它通过转运5-HT来调节突触间隙的5-HT水平。神经生化和神经内分泌研究表明,5-HTT抑制剂可通过提高突触间隙的5-HT水平而有效减少孤独症的仪式及刻板动作。

5-HTT基因定位于17qll.l-q12,含有15个外显子,长34 kb。5-HTT基因共有4种多态性:(1)第2内含子的数目可变的串联重复多态性(VNTRh(2)第4内含子上的一个静态突变;(3)C763A多态性,该多态性可引起编码蛋白255位亮氨酸(Leu)与蛋氨酸(Met)的置换,从而影响蛋白的功能;(4)5'端启动子区的一个44碱基插入缺失多态性(5-HT-TLPR),有两个等位基因即短等位基因(S)和长等位基因(L)。有研究表明第2内含子的VNTR具有功能性,可影响受体结构并与脑组织的发育有关[6]。5-HTTLPR多态性亦具有功能性,在细胞表达实验中,L/L型的表达率是L/S或S/S型的2倍,且在脑检及功能影像研究中发现中脑5-HTT结合力上升[7]。

Cook等[8]对86个孤独症的核心家系用传递不平衡检验(TDT)分析,未发现第2内含子VNTR多态性与孤独症之间存在连锁或关联;而5-HTTLPR的等位基因传递存在差异,S等位基因优先传递给患儿(P=0.03)。但Klauck等[9]发现L等位基因优先传递给患儿。Tordjtman等[10]对71个孤独症家系用TDT分析发现:5-HTTLPR等位基因在孤独症患者核心家系中的传递没有差别,但等位基因的传递倾向与社交障碍的严重程度相关,在严重障碍个体中S等位基因优先传递,而在轻中度障碍个体中L等位基因的传递具有优势。这表明HTT启动子等位基因本身不决定孤独症的易感性,可能与社交障碍的严重程度相关。此外,Maestrini[11]和Persico[12]等则报道未发现上述多态性与疾病存在关联。Zhong[13]等的病例对照研究也未发现5-HTTLPR与孤独障碍关联的证据[13]。但是，Cook等进一步将5-HTTLPR及第2内含子多态性作为单倍体进行多等位基因的TDT分析,结果证实等位基因传递的差异具有统计意义(P=0.018)[8],因此,5-HTT基因仍为孤独症的一个候选基因。Kim等的研究进一步证实5-HTTLPR和第2内含子VNTR单倍体存在传递不平衡,但是5-HTTLPR作为独立的标记并不存在传递不平衡。在后继研究中,研究者对5-HTT基因及其侧翼序列进行了测序,并针对新发现的多态性在81个核心家系中进行了TDT分析,结果发现有7个单核苷酸多态性(SNP),4个简单序列重复多态性(SSR)的等位基因的传递存在明显差异。结果提示其中有4个标志HTTSNP9 (P=0.0005)、HTTSNP11 (P=0.0007)、HTT-VNTR (P=0.001)、HTTSNP18(P=0.002)具有比5-HTTLPR更有力的传递不平衡证据[14]。这些结果仍是初步的,还要进行大量的重复验证。

2 儿童孤独症与5-HTR2A基因

5-HT通过其受体的转导来调节人的神经活动。在人体内,多种类型的5-GTR组成一个蛋白家族。根据5-HTR亲和力和功能的不同,可分为5-HTl,5-HT2,5-HT3,5-HT4,5-HT5,5-HT6,5-HT7七种亚型。

认知功能障碍是儿童孤独症的主要障碍之一,额叶皮质是与认知功能有密切关系的脑区,5-HTR系统主要分布在该区,5-HTR功能可能与儿童孤独症的发病有关。

5-HT受体家族成员之一5-HTR2A的基因定位于染色体13ql4-21区域,由三个外显子和两个内含子组成,产物为一个471个氨基酸组成的G蛋白偶联受体。有假说认为,儿童孤独症易感性的个体差异可能与其脑中5-HTR2A功能和表达水平的不同有关,5-HTR2A基因多态性部分影响5-HTR2A功能和表达水平。

5-HTR2A基因定位于13q14-21区域,目前共发现6种多态性,即2种静息多态性T102C(即第102位碱基出现T→C置换)和C516T(即第516位碱基出现T→C置换),4种结构多态性Thr25Asn(即第25位氨基酸出现Thr→Asn置换)、His452Thr(即第452位氨基酸出现His→Thr置换)和Ala447Val(即第447位氨基酸出现Ala→Val置换)及启动子区-G1438A多态性。结构多态性可直接改变所编码蛋白的氨基酸结构,从而改变受体的功能或表达水平,进而影响个体的疾病易感性。而静息多态性并不改变所编码蛋白的氨基酸结构,它本身不可能直接改变受体的功能或表达水平,但它可以通过间接地影响5-HTR2A基因的激活,或通过影响5-HTR2A二级结构的翻译及mRNA的稳定性,从而改变5-HTR2A的功能或表达水平。它也可以与疾病的真正致病基因连锁,而该致病基因是在5-HTR2A基因的其他可能影响受体功能或表达水平的调节区上,或在一个与静息多态性邻近的基因上。因此,研究两种类型多态性与疾病的关系都具有重要的意义。

5-HTR2A基因的第102.个核苷酸存在一个T-C的限制酶片段长度多态位点(102T/C),该位点突变率高达60%,成为研究5-HTR2A基因理想的遗传标记。Herault LC较欧洲白人儿童孤独症患者与年龄匹配的健康儿童的5-HTR2A基因T102C多态性的基因频率分布,结果未发现两组间5-HTR2A基因的基因型及等位基因频率有显著差异。

Veenstra-Vander Weele等[15]对5-HTR2A基因上的3种多态性的单倍型与孤独症之间关系进行了TDT分析。这3种多态性包括启动子-1438G/A多态性与102C/T,以及一个新发现的位于内含子1靠近外显子2的SNP,其导致外显子3第452位上His/Tyr置换。细胞表达研究显示HTR2A在大脑中有多态性印记,对母系和父系传递分别作二次分析,未发现单倍型不平衡传递;然而,效力分析揭示在小样本量确定亲本来源作用是低效的。

3 儿童孤独症与谷氨酸受体6(GluR6)基因的关系

谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质,谷氨酸及其受体直接参与认知活动如记忆和学习,是一些神经精神疾病的候选因子[16]。已经发现谷氨酸的NMDA和非NMDA受体共同参与长时程增强(LTP)的诱导,在海马诱导的LTP被认为是学习和记忆的神经基础,因此,谷氨酸在认知上起重要作用。它通过两种谷氨酸受体发挥作用:代谢调节型和离子通道型。代谢调节型受体通过GTP结合蛋白与各种第二信使相偶联,而离子通道型谷氨酸受体则根据其配体结构特性分为NMDA，APMP和kainate受体。Carlsson基于谷氨酸激动剂在健康人体中产生的效应与孤独症患者症状的相似性,提出孤独症可能是一种高谷氨酸疾病。高谷氨酸动物模型也显示了与孤独症的一些相似性,如缺陷行为,刻板重复行为。Moreno-Fuenmayor (1996)的临床病例对照研究报道称:儿童孤独症患儿血浆谷氨酸水平升高,而Rolf(1993)报道:孤独症患儿血小板谷氨酸水平则降低。

谷氨酸受体6(GluR6)基因定位于6q21,长670kb,有16个外显子,14个内含子。内含子12与外显示子12有相似的序列,核酸水平(A/G)的改变可导致蛋白质水平的变化(Q621R)。GluR6是一种离子通道型kainate受体(KARs),在涉及学习、记忆(海马)、运动及行为(基底节,小脑)的脑区域高度表达。GluR6功能是调节蛋白磷酸化,GluR6突变对兴奋性突触信号整合有重大影响,GluR6功能失调可能与孤独症社交及学习功能障碍有关。GluR6异常表达引起孤独症病人癫痫发作。

GluR6的mRNA编译功能障碍产生孤独症行为表现,GluR6在Q/R位点编译改变受体通道Ca的通透性。Jamain等(2002)已发现人类编译位点互补序列(ECS)位于第12内含子编码Q/R位点的序列,但序列分析研究认为孤独症组与对照组无差别。然而,双链RNA(dsRNA)结构的微小变化可改变编译过程。GluR6也可在另两个位点(I/V和Y/C)编译,但是,涉及此编译的序列不清楚。

巴黎国际孤独症同胞对研究合作项目(PARIS),对51个受累同胞对(ASP)进行研究发现染色体6q21区存在明显连锁,多位点最大LOD值(MLS)为2.23,GluR6基因就位于该区域。Jamain等[17]对5个独立的基因组进行了扫描,在染色体lp,2q,6q16-21,7q31-32,13q和15q上评估出最大LOD值(MLS)作为候选区,并用ASP和TDT两种方法在白种人群中进行大样本的研究,结果显示GluR6与孤独症易感基因存在连锁不平衡,他们建议在其他人群中进行重复验证,并用荟萃分析确定其相关度。由于目前的分析全部是基于遗传资料,因此应进行基因功能性研究以进一步确定GluR6在孤独症发生中的基因易感作用。

另有3个独立的研究证明:6q21与精神分裂症连锁,D6S424(102cM)和D6S423 (125cM)这两个标记与GluR6基因侧翼区明显连锁(P<0.0003)。高谷氨酸症是精神分裂症的假说之一,而孤独症与精神分裂症内向性思维等症状有相似之处。因此,GluR6基因也被作为是孤独症的一个候选基因。

4 儿童孤独症与GABA受体基因(GABRB3)的关系

GABA是一种氨基酸类神经递质,它调节癫痫发作的阈值,并与焦虑的发生相关,而在孤独症一级亲属中焦虑障碍发生率较高。

A型GABA受体的B3亚单位基因(GABRB3)定位于15q11-13区。细胞遗传学研究表明,15q11-13区的改变与孤独症有关[18],且孤独症症状与Prader-Willi和Angelman综合症相关,它们都存在有15q11-13区的基因变异,因此人们对15q11-13区进行了研究。Cook等(1998)对132个家庭该区域跨度为2Mb的9个标记作图,发现孤独症与GABRB3基因一个155CA-2标记存在连锁不平衡。Buxbaum(2002)对80个孤独症家系(由59个多发家系和21个核心家系组成)在155CA-2以及距155CA-2跨度150kb的另外四个标记(69CA、155CA-1、85CA、A55CA-1),用TDT (P<0.004)及MTDT(P<0.002)分析,认为孤独症与155CA-2相关联[19]。

Philippe对51个孤独症多发家系的基因组扫描显示:在CABRB3区有一个主峰LOD值大约为l,Bass等同样在此区域对63个家庭进行多位点连锁分析,在D15S217发现一个Z值为1.78的峰,而Martin等用同样的方法为123个家系进行研究没有观察到与155CA-2存在连锁不平衡,但发现与另下GABRB3上的标记存在传递不平衡。而Maestrim、Salmon用155CA-2及其他邻近的标记分析对94个和139个家庭组成的样本进行TDT研究也未观察到连锁不平衡。

以上结果不一致,这可能是由于他们所用的分析方法不同,种族不同,人群分层因素,另一个值得考虑的因素是孤独症的易感性涉及多个微效基因,因此连锁分析的结果很难得到重复。

5 儿童孤独症与其他候选基因

在对83个孤独症同胞对的全基因组扫描并进行的连锁分析,以及对69个同胞在13个候选区的119个标记进行基因分型研究的结果,进一步支持了前面报道的与7q,16p区域的连锁,此外还发现了两个新的连锁区2q及17q。Bandner和Gershon提出了一种新的研究方法:区域多重扫描可能性荟萃分析(MSP),并在7q位点得到了与孤独症相关的强有力证据,然而在该区域鉴定出特定易感基因仍有困难。Bonora等[20]用定位候选基因方法,试图在7q32找出相关的基因,他们对位于7q32-段长800kb区域中的4种相邻基因:PEG1/MEST,COPG2,CPA1和CPA5进行了研究,结果未发现它们与孤独症相关联。他们正在7q区寻找其他候选基因。

6 小结

寻找儿童孤独症易感基因的工作已进行多年,由于在研究中所采用多态性标记的不同,研究的种族不同,分析方法的差异,以及临床表型的异质性,所得到结果并不一致。要确定真正的易感基因还必须做大量的工作。但目前对候选基因所作关联研究的结果足以说明孤独症的发生具有明显的遗传基础,随着基因组工作的深入,必将会发现更多的候选基因。这无论对进一步理解孤独症的病理生理机制、克隆孤独症的易感基因、研制更有效的治疗药物以及探索早期诊断和基因治疗的策略都有重要的意义。

参考文献

1 Matthew WS, Paul JL, David LP, et al. The genetics of childhood psychiatric disorders: a decade of progress. Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 2000, 39(8) : 946～962
2 Gillberg C, Wing L. Autism: not an extremely rare disorder. Acta Psychiatry Scand, 1999, 99: 399～406
3 Peter ET. Pervasive Developmental Disorders: A10-Year Rieview.J Am. Acad Child Adolesc Psychiatry, 2000, 39(9) : 1079～1095
4 Veenstra-Vander Weele J, Anderson GM, Cook EH. Pharmacogenetics and the serotonin system: initial studies and future directions. European Journal of Pharmacology, 2000, 410: 165～181
5 Leboyer M, Philippe A, Bouvard M, et al. Whole blood serotonin and plasma beta-endourphin in autistic probands and their first-degree relatives. Biol Psychiatry, 1999, 45: 158～613
6 Fiskerstrand CE, Lovejoy EA. Quinn JP. An intronic polymorphic domain often associated with susceptibility to affective disorders has allele dependent differential enhancer activity in embryonicstem cells. FEBS Lett, 1999, 458: 171～174
7 Heinz A, Jones DW, Mazzanti C, et al. A relationship between serotonin transporter genotype and in vivo protein expression and alcohol neurotoxicity. Biol Psychiatry, 2000, 47: 643～649
8 Cook EH Jr, Courchesne R, Lord C, et al. Evidence of linkage between the serotonin transporter and autistic disorder. Mol Psychiatry, 1997, 2: 247～250
9 Klauck SM, Poustka F, Benner A, et al. Serotonin transporter (5-HTT) gene variants associated with autism? Hum Molec Genet,1997, 6: 2233～2238
10 Tordjman S, Gutknecht L, Carlier M, et al. Role of the serotoniin transporter gene in the behavioral expression of autism. Molecular Psychiatry, 2001, 6: 434～439
11 Maestrini E, Lai C, Marlow A, et al. Serotonin transporter (5-HTT) and gamma-aminobutyric acid receptor subunit beta3 (GABRB3) gene polymorphisms are not associated with autism in the IMGSA families. Am J Med Genet, 1999, 88: 492～496
12 Persico AM, Militemi R, Bravaccio C, et al. Lack of association between serotonin transporter gene promoter variants and autistic disorder in two ethnically distinct samples. Am J Med Genet,2000, 96: 123～127
13 Zhong N, Ye L, Ju W, et al. 5-HTTLPR variants not associated with autistic spectrum disorders. Neurogenetics, 1999, 2: 129～131
14 Kim S-j, Cox N, Courchesne R, et al. Transmission disequilbrium mapping at the serotonin transporter gene (SLC6A4) region in autistic disorer. Molecular Psychiatry, 2002, 7: 278～288
15 Veenstra-VanderWeele J, Kim SJ, Lord C, et al. Transmission disequilibrium studies of the serotonin 5-HT (2A) receptor gene (HTR2A) in autism. Am J Med Genet, 2002, 114: 277～283
16 Meldrum BS. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology. J Nutr, 2000, 130: 1007S～1015S
17 Jamain S, Betancur C, Quach H, et al. Linkage and association of the glutamate receptor 6 gene with autism. Mol Psychiatry, 2002,7: 217～220
18 Tager-Flusberg H, Joseph R, Folsteiin S. Current directions in research on autism. Ment Retard Dev Disabil Res Rev, 2001, 7: 21～29
19 Buxbaum JD, Silverman JM, Smith CJ, et al. Association between a GABRB3 polymorphism and autism. Molecular Psychiatry,2002, 7: 311～316
20 Bonora E, Bacchelli E, Levy ER, et al. Mutation screening and imprinting analysis of four candidate genes for autism in the 7q32 region. Molecular Psychiatry, 2002, 7: 289～301