5-羟色胺转运体基因多态性与儿童孤独症核心家系的关联研究

焦公凯1王伟勇1张志珺2王民洁1林节1邹冰1王晨阳1柯晓燕1陈一心1

(1.南京医科大学附属脑科医院,南京2100292.东南大学附属中大医院神经科)

基金:南京市卫生局资助项目(编号:JH0001)南京医科大学科技发展基金项目(编号:NY03080)

摘要：目的 探讨中国汉族人群5-羟色胺转运体基因多态性(5-HTTLPR)与儿童孤独症的关系。方法 应用聚合酶链式反应技术(PER),测定了82个儿童孤独症核心家系患儿及其父母的基因型和等位基因。结果 传递不平衡检验(TDT)显示等位基因传递无统计学意义(X2=0.014,P>0.05)。结论 5-HTTLPR与儿童孤独症没有关联,5一羟色胺转运体基因可能在儿童孤独症发病中不起主要作用。

关键词：儿童孤独症5-羟色胺转运体基因多态性传递不平衡检验

儿童孤独症(childhood autism)是一种广泛发育障碍,该病至今病因不明,有关孤独症的家系研究、双生子研究、细胞遗传学研究等表明遗传因素在孤独症的病因中起重要作用[1]。由于5-羟色胺转运体基因的功能和在基因组中的位置,它被认为是一种重要的孤独症候选基因[2]。为探讨中国汉族人群中5-羟色胺转运体基因对儿童孤独症易感性的作用,我们对82个儿童孤独症核心家系进行5-羟色胺转运体基因多态性(5-HTTLPR)的关联研究。

1 对象与方法

1.1 对象

所有研究对象均来自南京脑科医院儿童心理卫生研究中心,共有儿童孤独症核心家系82例(每例包括患者及与其有血缘关系的父母双亲),均为汉族,所有患者均符合精神疾病国际分类和诊断标准第10版(ICD-10)中有关儿童孤独症的诊断标准,其中男68例,女14例,年龄2～16岁,平均(4.29±2.16)岁,起病年龄平均(1.54±0.61)岁,病程平均(2.71±2.08)年。所有患者的父母均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

每个研究对象抽取静脉血2mL,EDTA抗凝,分离白细胞,按常规酚-氯仿提取法抽提模板DNA。

1.2.2 5-羟色胺转运体基因的基因分型

采用聚合酶链式反应技术,PCR引物如下:正向5'-GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3',反向5'-GAGGGACTGAGCTGGACAACCAC-3',采用大连宝生物公司TaKaRaLA TaqTM试剂盒。PCR反应液共25μL,含有50 ng基因组DNA,10 pmol引物,1 U LA-Taq酶,10μL 2倍GC缓冲液(BⅡ),250μmol/L dNTPs。PCR条件:94℃5 min预变性,继以94℃变性60 s,61℃退火30 s,72℃延伸60 s,共30个循环,72℃终末延伸10 min。将PCR产物于10%非变性聚丙烯酰胺中电泳分离,以银染法检测各区带,484 bp片段为S型,528 bp片段为L型。

1.3 统计学方法

分析计算基因型和等位基因频率,进行Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验,各组间频数比较用χ2检验,在父母基因型为杂合子的核心家系中应用传递不平衡检验(TDT)来分析等位基因与儿童孤独症的关联。

2 结果

2.1 5-HTTLPR基因型分布和等位基因频率

χ2吻合度检验显示基因频率分布符合H-W平衡法则。患儿与其父母的等位基因频率和基因型频率的分布无显著性差异(P>0.05)(表1)。

2.2 等位基因与儿童孤独症的关联性

根据父母基因型在患病子女中传递情况,在82个核心家系中对符合TDT分析条件的57个家系进行分析,按McNemarχ2=(b-c)2/(b+c)计算,显示5-HTTLPR等位基因传递无统计学意义(P>0.05)(表2)。

3 讨论

5-HT系统异常是解释儿童孤独症病因的主要神经生化假说之一[3,4]。我们曾研究发现,孤独症患者血浆5-HT水平高于健康对照组[5],李思特等[6]观测33例儿童孤独症血浆5-HT,发现9例(27.3%)5-HT水平高于正常儿童水平的1.67个标准差,但临床特征与5-HT水平正常的24例儿童孤独症相同。另有研究发现部分孤独症患者外周和尿中5-HT水平升高,随着临床症状的改善血中5-HT水平下降。5-HT转运体(5-HTT)在5-HT释放后再摄取中起重要作用,具有调节和运输5-HT功能。它通过转运5-HT来调节突触间隙的5-HT水平。神经生化和神经内分泌研究表明,5-HTT抑制剂可通过提高突触间隙的5-HT水平而有效减少孤独症的仪式及核板动作。人类5-HTT由染色体17q12上的单基因(SLC6A4)所编码,有2个重要的多态性位点,其中,5-HTTLPR位于5-HTT基因转录启动部位的上游约1 kb处,由16个重复元件组成,其多态性涉及6～8个重复元件含44 bp的插入(L型)或缺失(S型)。该功能性多态性与基因的转录活性高低有关,有研究显示,S型等位基因的转录活性明显低于L型[7]。研究表明儿童孤独症与5-HTT基因多态性有关,但结果并不一致。因此,有必要做进一步的研究。

本研究以5-HTTLPR多态性作为遗传标记,对中国汉族人群中的儿童孤独症患者进行关联研究,比较孤独症患者与其双亲两组基因型分布及等位基因频率,未发现两组之间有显著性差异。采用以家系为基础的传递不平衡检验(TDT)来探讨5-HTTLPR多态性与儿童孤独症的关系,结果显示5-HTTLPR多态性与儿童孤独症无关联,这一结果与Tordjiman等[8]、Maestrini等[9]、Persico等[10]的研究相一致。Zhong等[11]的病例对照研究也未发现5-HT-TLPR与孤独障碍关联的证据。但是,也有不同结果。Cook等[12]发现5-HTTLPR等位基因传递存在差异,S等位基因优先传递给患儿;而Klauck等[13]发现L等位基因优先传递给患儿;Kim等[2]的研究报道:5-HTTLPR和第2内含子VNTR单倍体存在传递不平衡,但是,5-HTTLPR作为独立的标记并不存在传递不平衡。结果不一致可能由遗传异质性导致,儿童孤独症是多基因复杂性疾病。

本研究结果显示5-HT转运体基因与中国汉族人群儿童孤独症无显著相关,但是,并不能完全排除5-HT转运体基因在儿童孤独症致病机理中的作用。今后应采用更大的核心家系样本,进一步研究5-HT转运体基因上其它功能性多态性位点在儿童孤独症发病机理中的作用。

参考文献

1 Matthew WS, Paul JL, David LP, et al. The genetics of childhood psychiatric disorders: a decade of progress,J Am Acad Child Adolesc Psychiatry, 2000, 39(8) :946．
2 Kim S-J, Cox N, Courchesne R, et al. Transmission disequilibrium mapping at the serotonin transporter gene (SLC6A4) region in autistic disorder. Molecular Psychiatry, 2002, 7(3) :278．
3 Veenstra-Vander Weele J, Anderson GM, Cook EH. Pharmacogenetics and the serotonin system: initial studies and future directions. Eur J Phar-macol, 2000, 410(2-3) :165．
4 Cook EH, Crotts M, Leventhal BL. Autistic disorder and other pervasive developmental disorders. In: Klykylo WM, Kay J, Rube D eds. Clinical Child Psychiatry. 1st ed. Philadelphia: Saunders, 1998． 337-355．
5 焦公凯,王伟勇,张志珺,等.儿童孤独症血浆5-羟色胺水平的对照研究.临床精神医学杂志,2003,13(6) :334．
6 李思特,李雪荣,张献共,等.儿童孤独症血浆5-羟色胺的测定.中国神经精神疾病杂志,2003,29(4) :279．
7 Lesch KP, Bengel D, Heil A, et al. Association of anxiety-related traits with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulatory region. Science, 1996, 274(5292) : 1527．
8 Tordjman S, Gutknecht L, Carlier M, et al. Role of the serotoniin transporter gene in the behavioral expression of autism. Mol Psychiatry, 2001, 6(4) :434．
9 Maestrini E, Lai C, Marlow A, et al. Serotonin transporter (5-HTT) and gamma-aminobutyric acid receptor subunit beta3(GABRB3) gene polymorphisms are not associated with autism in the IMGSA families. Am J Med Genet, 1999, 88(5) :492．
10 Persieo AM, Militemi R, Bravaccio C, et al. Lack of association between serotonin transporter gene promoter variants and autistic disorder in two ethnically distinct samples. Am J Med Genet, 2000, 96(1) : 123．
11 Zhong N, Ye L, Ju W, et al. 5-HTTLPR variants not associated with autistic spectrum disorders. Neurogenetics, 1999, 2(2) : 129．
12 Cook EH Jr, Courchesne R, Lord C, et al. Evidence of linkage between the serotonin transporter and autistic disorder. Mol Psychiatry, 1997, 2 (3) : 247．
13 Klauck SM, Poustka F, Benner A, et al. Serotonin transporter(5-HTT) gene variants associated with autism? Hum Mol Genet, 1997, 6(13) : 2233．