儿童孤独症谱系障碍患者的母亲肠道菌群组成特征及其对疾病预测价值的研究

徐玉兵1，刘兴晖2，张蜀豫3，肖玲1，程雅婷4，孟晓伟1，陈禹1
（1.上海金域医学检验所有限公司，上海201301；2.上海市浦东新区公利医院，上海200135；3.海军军医大学附属东方肝胆外科医院，上海200438；4.广州金域医学检验中心有限公司，广州510330）

摘要：目的研究孤独症谱系障碍（Autismspectrumdisorder,ASD）儿童的母亲肠道菌群组成的特点，基于微生物生态学方法发现具有早期ASD临床辅助诊断意义的生物标志物。方法回顾性分析了76例ASD儿童的母亲和47例正常发育（Typicaldevelopment,TD）儿童的母亲粪便中肠道菌群高通量测序数据。对数据进行质控、剪切、拼接和降噪，得到扩增序列变异（ampliconsequencevariants,ASVs），基于ASVs相对丰度的相关性建立具有生态学意义的17个丰度共变化群（co-abundancegroups,CAGs），比较ASD儿童母亲和TD儿童母亲CAGs的差异，判别两组人群的生物标志物。结果基于ASVs相对丰度的相关性建立的17个CAGs，其中，CAG8主要由属于Bacteroides的肠道细菌组成，CAG10主要由属于Collinsella的肠道细菌组成，而CAG16主要由属于Erysipelotrichaceae和Lachnospiraceae的肠道细菌组成。比较这些CAGs相对丰度的结果显示，ASD儿童的母亲CAG10的相对丰度（3.37±0.76）较TD儿童的母亲（0.95±0.25）显著升高，差异具有统计学意义（U=1393，P=0.038）；与TD儿童的母亲相比，ASD儿童的母亲CAG8（7.27±1.11vs12.98±2.14）和CAG16（0.7±0.06vs1.37±0.33）显著降低，差异具有统计学意义（U=1252和1387，P=0.005，0.038）。基于这些变化的肠道细菌建立的肠道紊乱指数（gutdysbiosisindex,GDI）具有区别ASD儿童的母亲和TD儿童的母亲的潜力，当GDI以-1.073为阈值时，其敏感度和特异度分别为93.4%和80.9%。结论ASD儿童的母亲肠道细菌组成失调，基于母亲的肠道菌群计算的生物标志物可用于ASD儿童的早期诊断。
关键词：孤独症谱系障碍；母源肠道菌群；肠道紊乱指数；丰度共变化组
中图分类号：R749.94；R446.5文献标识码：A文章编号:1671-7414（2022）05-065-05

孤独症谱系障碍（autismspectrumdisorder,ASD）是一组精神发育障碍的统称，其核心临床表现为社交损伤、行为方式刻板和兴趣狭窄[1]。来自世界各地的流行病学调查研究显示ASD发病率在3～17岁儿童中逐年升高[2]。目前还不明确ASD的确切病因，肠道菌群作为环境因素之一可能与ASD的发生发展有关[3-4]。母亲以多种方式将肠道菌群传递给子代，称为母源肠道菌群的垂直传递，这对子代菌群的建立非常关键。明确母源肠道菌群对子代的影响可能对ASD的早期诊断和早期干预具有重要意义。有研究显示，垂直传递不仅与传递方式有关，也与母亲自身的肠道菌群组成有关[5]。
传统的研究肠道细菌的方法基于分类学地位，然而肠道细菌的功能具有菌株特异度[6-7]，这种研究方法可能将功能不同的细菌归为一类。实际上，人体的肠道微生物形成一个独特的生态环境，其中功能相似的细菌形成独特的功能团影响人体的健康。相对于传统的基于分类学地位的分析方法，基于微生物生态学的研究方法可能更准确地揭示肠道菌群与人类疾病的关系[8]。
然而，目前利用生态学方法揭示ASD儿童母亲肠道菌群组成特征并且基于此特征发掘对ASD诊断具有临床意义的生物标志物的研究还非常缺乏。因此，本研究对已经公开的ASD儿童母亲（mothersofchildrenwithASD,MA）和正常发育儿童母亲（mothersofchildrenwithtypicaldevelop-ment,MT）的肠道菌群数据，基于生态学的概念进行全新的分析，以期探究ASD儿童母亲的肠道菌群特征并且发现具有诊断意义的生物标志物。

1材料和方法

1.1研究对象

本研究回顾性分析了先前发表的研究中的MA和MT的肠道菌群（16SrRNA基因V3-V4区）测序数据，其中MA组为76例，MT组为47例[9]。人群基础信息和分组信息见于已经发表的研究，此研究在中国临床试验注册中心注册，注册号为ChiCTR-RPC-16008139。

1.2方法

1.2.1生成扩增序列变异：人群肠道菌群测序数据下载于NCBI的SRA（shortreadarchive）数据库，项目号为PRJNA644763。利用2022.02版QIIME2（quantitativeinsightsintomicrobialecology）软件进行生物信息处理，具体包括：①在QIIME2中导入fastq.gz文件；②依据文献中的描述切除PCR引物的序列信息；③质控序列信息；④利用QIIME2中的DADA2指令降噪；⑤基于重叠的长度不小于20的原则拼接序列，获得各个样本的扩增序列变异（ampliconsequencevariants,ASVs）丰度文件和代表序列文件；⑥将所有的样本的序列数均一化到10000，获得各个样本细菌的相对丰度；⑦在SILVA参考数据库（136版）中注释ASVs的分类地位（80%相似度）。
1.2.2肠道细菌丰度共变化组的建立：在软件R（3.5.1版）中，将10%以上MA和MT共有的160个ASVs划分为丰度共变化组（co-abundancegroups,CAGs），包括如下步骤：①计算各个ASVs相对丰度的相关性（Spearman’s相关系数），得到R值矩阵；②利用软件R（3.5.1版）中的基因相关网络分析（weightedgenecorrelationnetworkanalysis,WGCNA）数据包，将R值矩阵作为WGCNA中的TOM（topologicaloverlapmatrix），从而得到dissTOM矩阵；③基于dissTOM矩阵，利用Ward.D2算法建立聚类树，此树上ASVs距离越小表示其相对丰度变化越相似，基于此原理，计算ASVs之间的相似度值(β),当β值≥1时，ASVs被划分为同一个CAG。单个CAG中不少于5个ASVs（minClusterSize=5）。除此之外，CAGs中各个ASVs的相对丰度之和为此CAG的相对丰度。1.2.3肠道紊乱指数（Gutdysbiosisindex,GDI）的计算：基于先前的研究计算GDI；
    ∑CAGa
A
其中∑CAGa代表在MA中升高并且有统计学意义的CAGs相对丰度之和，∑CAGt代表在MA中降低并且有统计学意义的CAGs相对丰度之和，A代表在MA中升高并且有统计学意义的CAGs的数目，T代表在MA中降低并且有统计学意义的CAGs的数目[10]。
1.3统计学分析本研究所有的统计学分析均使用SPSS软件（IBM，version26.0）完成。利用MannWhitneyU检验分析MA和MT之间CAGs相对丰度的差异是否具有统计学意义。P＜0.05为差异有统计学意义。利用“leave-one-out”交叉验证检验GDI的受试者操作特征曲线（receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC）模型，P＜0.05为差异有统计学意义，并且利用尤登系数计算模型阈值，以及对应的敏感度和特异度。

2结果

2.1ASD儿童母亲和TD儿童母亲肠道菌群组成比较

利用QIIME2对先前研究[9]的ASD儿童母亲（76例）和TD儿童母亲（47例）的粪便样本中菌群测序数据进行质控、拼接和降噪，最后获得2725224高质量序列，平均测序量为221563，方差值为40636，合计3620个ASVs。
为了基于微生物生态学的角度探究ASD儿童母亲相对于TD儿童母亲肠道菌群组成的特征性变化。利用10%以上MA和MT体内可以检测到的160个ASVs建立了丰度共变化网络，基于此网络将这些ASVs划分为17个CAGs，见图1A和1B。
A.由160个ASVs构建的丰度共变化网络。节点的面积代表ASVs的平均丰度，连接节点的线的宽度代表相关系数的绝对值，红色的线代表它连接的2个节点正相关，蓝色的线代表它连接的2个节点负相关。B.基于ASVs之间的相对丰度相关系数，160个ASVs划分为17个肠道细菌CAGs。MA：76例；MT：47例。
图1利用10%以上MA和MT共有的160个ASVs建立丰度共变化网络的CAGs利用曼-惠特尼U检验比较MA和MT的CAGs相对丰度，发现CAG8，CAG10和CAG16在这二组间的差异具有统计学意义，见表1。并且CAG8和CAG16的相对丰度在MA中降低，而CAG10在MA中升高。CAG8主要由属于Bacteroides的ASVs组成。CAG10主要由属于Collinsella的ASVs组成。CAG16主要由属于Erysipelotrichaceae和Lachnospiraceae的ASVs组成，见表2。

2.2基于肠道菌群特征性变化计算的GDI具有区分MA和MT能力见图2。基于CAG8，CAG10和CAG16的相对丰度，依据先前研究中GDI的计算方法[10]分别计算MA和MT的GDI（2.66±0.76vs-6.22±1.16）。以GDI和分组信息建立ROC模型，经过“leave-one-out”交叉验证，发现ROC模型的曲线下面积为0.913（95%置信区间为：0.864～0.971），并且P＜0.01，表明模型具有区分MA和MT的潜能。基于尤登指数，计算最佳阈值，发现GDI为-1.073时，GDI的敏感度为0.934，特异度为0.809。
注：利用“leave-one-out”交叉验证检验GDI的ROC，图中的点表示基于尤登检验得到的GDI的阈值，以及对应的敏感度和特异度。AUC表示ROC的曲线下面积。

3讨论

人类不仅有“血脉”，还有“菌脉”，或者称之为母源肠道菌群垂直传递，其途径包括胎盘途径、产道途径、母乳途径、皮肤接触等[11]。母源肠道菌群垂直传递对子代肠道菌群的早期建立至关重要，并且持续影响着子代肠道菌群的功能。母源肠道菌群垂直传递通过影响子代的肠道菌群组成间接调控子代能量代谢、神经系统发育等在内的多项生理过程。母源肠道菌群与包括精神发育障碍在内的多种疾病有关。CHEN等[9]发现ASD儿童母亲肠道菌群整体结构、多样性和丰富度相比于TD儿童母亲无显著差异，而儿童和母亲共有特定的肠道细菌与ASD的临床症状有关，提示ASD儿童母源肠道菌群垂直传递可能发生了改变。
KIMURA等[12]研究发现母亲肠道菌群的垂直传递的改变可能与子代罹患ASD有关，而影响肠道菌群垂直传递的因素一方面包括传递途径，比如生产方式、喂养方式等；另一方面也包括母亲自身的菌群组成。本研究结合微生物生态学的研究方法发现相对于TD儿童母亲，属于Collinsella的肠道细菌相对丰度升高、而属于Bacteroides，Erysipelotrichaceae的Lachnospiraceae的肠道细菌降低。而母体中Collinsella的升高或者Bacteroides和Lachnospiraceae的降低可能与子代罹患ASD的风险有关。Collinsella中的成员可以使集体长期处于低水平的炎症反应中[13]，而母孕期间的急性或者慢性炎症是子代罹患ASD的高风险因素之一。HSIAO等[14]研究发现免疫激活母鼠（immuneactivatedmothers,MIA）的子代相比于野生型小鼠子代表现出诸如社交损伤、刻板等ASD样行为症状和肠道慢性炎症，将BacteroidesfragilisNCTC9343灌胃于MIA子代，发现此菌株有效缓解了MIA子代ASD样行为症状，显著降低了慢性炎症水平。属于Lachnospiraceae的很多肠道细菌成员可以产生短链脂肪酸，如丁酸。一项研究发现，丁酸可减轻小鼠胚胎、成纤维细胞和人胚肾293细胞中赖氨酸23中组蛋白H3的酰化缺陷。而这种缺陷是发育迟缓儿童的重要特征之一。因此，丁酸可能缓解儿童的发育迟缓[15]。这些研究表明本研究发现的特征性变化的母源肠道细菌可能在ASD的发生发展中扮演着角色。
在探究疾病与肠道微生物的关系时，发现与特定的疾病症状具有相关关系甚至因果关系的特定成员至关重要。然而因为肠道细菌的复杂性和多样性，肠道微生物组数据集具有高维度、稀疏的特点。此特征导致很难发现与特定临床症状密切相关的肠道细菌。因此一些分析方法用以降低微生物组数据集的维度和稀疏性，如Taxon-based方法。虽然这些分析方法有效降低了数据集的维度和稀疏性，但是他们往往依赖于先前的经验，把具有不同功能的肠道细菌视为一类，从而导致研究结果不一致。然而，在人体肠道这个生态系统中，细菌之间很可能形成功能上互相联系的群体（Giuld），从而以相互关联的方式影响人类的生命活动。同一个Giuld中的成员表现出丰度共变化的特点，可以基于这种特点将肠道菌群进行降纬和聚类，比如构建CAGs[8]。ZHAO等[16-17]的研究表明，Giuld-based分析可能是更具有生态学意义的降低微生物组数据集维度的方法，基于此方法有可能找到在人类疾病中扮演着关键角色的肠道细菌。本研究不仅通过Giuld-based的分析方法发现了ASD儿童母亲肠道菌群的特征性变化，而且基于这些变化得到了判别ASD儿童母亲和TD儿童母亲的生物标志物。
本研究检测人群的粪便样本，样本便于保存和运输，并且为非侵入性检测项目，无安全隐患。但本研究也存在一定的不足，首先非多中心研究，生活习惯、饮食习惯等环境因素可能系统性干扰研究结果；其次样本量较小；再次本研究为回顾性研究。所以，未来可以开展多中心、更大人群的前瞻性研究，检验此指数预测子代罹患ASD风险的能力，为ASD的早期诊断提供临床指导。
综上所述，本研究明确了ASD儿童母亲肠道菌群特征，发掘了具有早期诊断ASD潜能的指标，这为未来肠道菌群运用于ASD临床诊疗提供了新的方向。

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