孤独症谱系障碍儿童全血多种元素水平分析与诺模图的构建

张羽珊1,于梦雪2,阿斯木古丽•克力木1*

1.新疆医科大学公共卫生学院(中国乌鲁木齐830011)；

2.新疆维吾尔自治区妇幼保健院(中国乌鲁木齐830011)

[摘要]目的分析孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder,ASD)儿童全血多种元素水平与ASD发生风险之间的关系，建立和验证预测儿童孤独症发病风险的个体化诺模图。方法对2018年在乌鲁木齐某三甲医院门诊招募的226名儿童志愿者(ASD患儿113例，健康儿童113例)的基本信息和全血多种元素检测数据进行回顾性分析。应用R软件将226名儿童随机分为开发组(182例)和验证组(44例)，采用单因素和多因素Logistic回归分析筛选影响儿童ASD发病的独立危险因素。根据回归系数绘制相应的诺模图预测模型并估计预测模型的区分度和校准度。结果多因素Logistic回归分析结果显示，性别及血铜、血锌、血镁水平是儿童ASD发生的独立危险因素。开发组和验证组的受试者工作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲线下面积分别为0.782和0.740,预测模型的判别能力较好。利用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验评价预测模型的校正结果，2组校准试验的P值分别为0.867和0.816,预测模型具有较强的一致性。结论诺模图预测模型可应用于ASD儿童的个体化预测，有助于ASD高风险儿童的筛查和早期识别。

[关键词] 孤独症谱系障碍； 诺模图； 血锌；血镁

基金项目新疆维吾尔自治区自然科学基金(2017D01C225);新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJ2019G212)通信作者(Correspondingauthor)阿斯木古丽•克力木，博士，副教授，硕士生导师

前言

孤独症谱系障碍（autismspectrumdisorder,ASD）是一类较为严重的神经发育性疾病，大多起病于儿童时期⑴。该病的临床表现以刻板行为的重复和社会互动的缺陷为主。ASD的发病机制目前仍未能明确，普遍认为其发生与特定基因有关,并且可能是可遗传的⑵。此外，ASD可能与微量元素代谢的紊乱有关，如锌和铁缺乏。近年来,全球范围内的孤独症患病率日益增加，对公众健康产生了巨大的影响，因而对ASD发病机制的研究也备受关注。ASD患儿的血样中铜（Cu）、锌（Zn）、硒（Se）等微量元素水平与患儿症状表现程度之间的关系引起了许多学者的极大兴趣。有证据DM表明，微量元素的动态平衡和它们潜在的神经毒性已成为ASD的病因之一。孕期母体及婴幼儿生长发育期的微量元素水平对儿童脑结构和功能的发育起着重要的作用⑶。世界卫生组织提出，ASD的治疗原则是早发现、早干预、早康复。研究结果⑹证实，早期诊断和干预对ASD儿童的预后可产生极为重要的影响。本研究旨在分析与评价ASD患儿全血元素（包括多种微量元素及25-羟维生素D）水平，并建立可靠、准确的风险预测模型，探讨以全血元素水平作为儿童ASD生物学指标的可能性，为早期识别和筛查ASD高风险儿童提供新思路。

1对象与方法

1.1对象和分组

1.1.1研究对象2018年1月一2018年12月乌鲁木齐市某三甲医院以及乌鲁木齐市某残疾人联合会招募儿童志愿者226名，其中ASD患儿113例（男性91例，女性22例），健康儿童113例（男性76例，女性37例）；年龄2~7岁，平均年龄（4.39±L38）岁。所有调查与检测均征得受试者家属的知情同意并签定知情同意书。

1.1.2纳入标准ASD患儿纳入标准⑺：①经2位专业医师确诊，符合《美国精神障碍诊断与统计手册第5版》中ASD的诊断标准⑻；②年龄为2〜7岁；③无代谢性疾病，无精神分裂症、单纯性精神发育迟滞等其他精神类疾病或疾病史；④无脑瘤、脑瘫及其他疾病或疾病史，智力正常;⑤调查前30d内未使用过任何药物或保健品。健康儿童纳入标准：①无躯体、神经系统疾病和精神疾病或疾病史，智力正常；②调查前30d内未使用过任何药物或保健品。

1.2研究方法

1.2.1全血多种元素检测检测遵循实验室相应的规章制度，在无菌操作的基础上进行。嘱所有ASD儿童和健康儿童清晨空腹，用一次性釆血针采集儿童无名指末梢血80|ulL,立即注入试剂盒专用配套试剂，4t保存待测。釆用北京博晖创新光电技术股份公司提供的BH2100鸨舟原子吸收光谱仪通过火焰原子吸收分光光度法测定样本中元素铜、锌、钙、铁、镁的含量⑼。采用日立（HITACHI）Z-2700原子吸收光谱仪通过石墨炉原子吸收光谱法测定样本中铅和镉的水平。采用日本岛津有限公司提供的ICPMS-2030电感耦合等离子体质谱仪，通过电感耦合等离子体质谱检测法测定25-羟维生素D的含量。

1.2.2数据分组应用R软件将所收集的226名ASD患儿及健康儿童的数据进行随机分组。将全部数据随机分为2组：开发组数据用以建立模型,包括182名儿童（男性134名，女性48名）的数据；验证组数据用以带入模型评估其区分度和校准度，包括44名儿童（男性33名，女性11名）的数据。

1.3统计学分析

釆用SPSS21.0统计软件和R3.6.0统计软件完成统计分析过程。定性资料用频数和百分比（71,%）表本，定量资料用成土S表示0由于本研究获得的所有测量数据并非均服从正态分布或满足方差齐性，因此针对满足方差齐性的数据采用两独立样本的t检验分析2组差异，对不满足方差齐性的数据则应用两独立样本的秩和检验进行分析。采用单因素Logistic回归和多因素Logistic回归分析完成预测因素的筛选。将具有统计学意义的单因素分析变量加入多因素Logistic回归分析中，并采用正向逐步回归方法选择最终纳入模型的变量。根据自变量回归系数建立ASD儿童相关的个体化诺模图预测模型U°-11]o从区分度和校准度2个方面评价预测模型。预测模型的区分度是指它能够区分ASD儿童和正常儿童的能力，通常是通过计算受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic,ROC）曲线下面积（areaundercurve,AUG）来评估二分法的结果判别〔⑵。预测模型的校准度是指预测概率与观测概率的一致性。

2结果

2.1开发组与验证组儿童数据的比较

开发组和验证组儿童的基本情况和全血多种元素水平的差异均无统计学意义(P>0.05,表1)。 明4个独立危险因素之间不存在多重共线性。表2开发组的单因素和多因素Logistic回归分析2.2诺模图的构建

对开发组的单因素Logistic分析显示，有统计学意义的危险因素包括性别以及儿童血样中铜、锌、镁、铁的水平。年龄、体质量指数及儿童血样中钙、铅、镉及25-羟维生素D的水平则与ASD的发生无关。将上述具有统计学意义的变量纳入非条件二元多因素Logistic回归模型，分析结果显示性别、血铜、血锌和血镁水平是儿童ASD的独立危险因素(表2)。对上述独立危险因素进行共线性诊断，方差膨胀因子(varianceinflationfactor,VIF)分别为1.056、1.016、1.167和1.003,

以多因素Logistic回归分析的结果为依据，将所得到的4个独立危险因素纳入预测模型，以建立ASD的个体化诺模图预测模型(图1)。诺模图的应用方法如下：首先以诺模图为基础，得到某儿童各预测指标对应的积分，将积分之和记录为总分，总分所对应的预测风险即为该儿童患ASD的概率。例如，某儿童性别是男性，计21分；其血铜水平为1.50|ixmol/dL,计22分；血锌水平为5.00jimol/dL,计67分；血镁水平为1.45mmol/L,计45分；各项指标的累计总分为21+22+67+45=155分，相应的ASD预测危险度为0.84(84%)。图1诺模图预测ASD患病可能性

2.3诺模图的验证

模型的验证通常基于区分度和校准度2个方面登依据所绘制的ROC曲线，可以计算得到开发组和验证组的AUC值[I3-I4]O开发组和验证组算得的ASD患病风险AUC值分别为0.782和0.740（图2）,提示本研究建立的诺模图预测模型的区分性较好。图2ROC曲线用于验证诺模图的识别力。注：A.开发组；B.验证组。

米用Hosmer-Lemeshow拟合优度检验，对预测模型的结果进行评价并得到校正曲线（图3）,结果显示2组校准试验的P值分别为0.867和0.816,模型的预测概率与实际概率一致，因此证明预测模型一致性较强，开发组和验证组的模型校准都较为完善。图3ASD儿童的诺模图校准曲线图。注：A,开发组；B.验证组。

3讨论

ASD的成因复杂，症状表现轻重不一零国内外学者经过几十年的研究和调查，仍未能明确其病因。目前来看，多数研究认为儿童ASD主要是受生物学因素影响而逐步发展为脑结构和脑功能的异常。有研究结果'⑸表明，遗传因素相对于环境因素来说对ASD发病的贡献更大。要进一步了解ASD的病因、本质和治疗方法，还需要不断加强对遗传学和神经学的探索[⑹。还有研究结果〔⑺表明，许多金属元素在维持人类健康方面发挥着重要作用，微量元素失衡是各种身体和精神疾病的一个重要的影响因素。微量元素的缺乏与ASD的发生存在一定的关系。

目前，诺模图作为一种可信度高的预测手段被广泛应用于肿瘤学等医学相关的研究中。本研究将诺模图应用于ASD患儿全血微量元素的研究,开发并验证了一种新的预测工具，仅使用4个较为容易获得的变量即可预测儿童罹患该病的风险。将基线数据的风险因素合并到一个易于使用的诺模图中，有助于对ASD儿童进行个性化预测。

研究结果表明，性别是儿童患ASD的独立危险因素，即男性儿童发病的风险约为女性儿童的2.7倍。锌对蛋白质和核酸的形成具有重要作用,并且可以促进机体生长发育和组织再生。缺锌则会导致儿童体内含锌酶减少，从而使神经细胞中DNA、RNA的含量减少，影响细胞的分裂增殖,进一步影响儿童脑结构和功能发育。已有研究发现，严重缺锌的患者可发生神经心理变化，如情绪不稳定、易怒和抑郁症。本研究发现，儿童的血锌水平越低，则患ASD的风险越大，这与相关研究的结果一致有研究结果啊表明，ASD患儿体内的铜水平可能与其症状严重程度呈正相关。这与本研究结果存在偏差，可能由于本研究数据量较少造成。镁是人体利用维生素B6过程中必不可少的元素，具有良好的镇静作用，儿童体内镁缺乏则会引起焦虑、抑郁、多动、激动、幻觉、易怒、紧张、攻击性、慢性压力、学习障碍和记忆障碍等症状。另有研究⑵“2]表明，ASD儿童在每天补充维生素B6和镁的情况下表现出明显的症状改善。有证据[习表明，ASD儿童头发中的镁含量明显降低。本研究也表明，镁是儿童患ASD的独立保护因素，儿童血镁水平越低，则罹患ASD的风险越高。

依据本研究结果，将影响ASD发生的上述4个危险因素纳入预测模型可得出个体儿童罹患该病的概率，以这种方法量化儿童的发病风险简单易行，并且结果可靠。随着ASD病因相关研究的进展以及样本规模的扩大，可纳入模型的变量会不断增加，预测模型的精确度也会因此得到进一歩提升，这一模型有助于对ASD高风险儿童进行筛查和早期识别，或可应用于临床提高诊断效率。

本研究是诺模图在新疆地区ASD研究中的首次应用，诺模图表现直观、结果可靠，能够帮助一般人群和临床医师更轻松地了解ASD的患病风险。然而本研究在以下方面仍有局限性：首先，由于ASD病因尚未明确，诊断方法也较多依靠于量表及专业医师对儿童的行为评估，因此本研究中纳入的对ASD临床诊断具有意义的变量尚显不足。其次，本研究中使用的数据仅来自新疆乌鲁木齐市某三甲医院门诊及乌鲁木齐市某残疾人联合会，这可能会限制结果的外推。因此在未来的研究中，我们需要持续收集更多包括有意义的ASD临床诊断变量在内的相关数据，以使模型精度获得进一步提升，推动预测模型在临床诊断上的应用。

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