静宁颗粒调节ADHD大鼠胃肠功能及脑肠肽水平的实验研究

于庆洋1,2王俊宏3
                    (1.重庆医科大学附属儿童医院中医科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/认知发育与学习记忆障碍转化医学重庆市重点实验室,重庆4000142.北京中医药大学,北京1000293.北京中医药大学东直门医院儿科,北京100700)
                

【摘要】：目的：研究静宁颗粒对注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactive disorder, ADHD)大鼠的胃肠功能和脑肠肽的影响。方法：将50只SPF级4周龄雄性SHR大鼠按照随机数字表法分为模型组、盐酸托莫西汀组(5.36 mg·kg-1)及静宁颗粒高(30 g·kg-1)、中(15 g·kg-1)、低(7.5 g·kg-1)剂量组，每组10只，并以10只同周龄雄性Wistar大鼠作为空白组，各组大鼠给予相应药物灌胃，空白组及模型组给予去离子水灌胃，每日1次，给药6周。旷场实验评估大鼠行为学变化；灌胃炭末混悬液评价大鼠的胃内容物残留率和小肠推进率；ELISA检测大鼠血清胃泌素(gastrin, Gas)、胃动素(motilin, MTL)、饥饿素(ghrelin, GHRL)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、P物质(substance P,SP)的水平。结果：与空白组比较，模型组大鼠运动总路程明显延长，静止时间明显缩短，中心区域运动时间明显延长，周围区域运动时间明显缩短，小肠推进率及血清GAS、MTL、Ghrelin、SP水平明显降低，胃内容物残留率、血清VIP水平明显升高；与模型组比较，各给药组大鼠运动总路程明显缩短，静止时间明显延长，中心区域运动时间明显缩短，周围区域运动时间明显延长，血清MTL、Ghrelin水平明显升高，VIP水平明显降低；静宁颗粒高、中剂量组大鼠小肠推进率及血清GAS、SP水平明显升高，胃内容物残留率明显降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论：静宁颗粒可以改善ADHD大鼠胃肠道功能，调节脑肠肽水平。
【关键词】：静宁颗粒注意缺陷多动障碍胃肠功能脑肠肽大鼠
中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1674-8999(2023)05-1047-06

基金:北京市自然科学基金项目(7192118)
作者简介:于庆洋(1994-),男，山东东平人，医学博士，研究方向：中医药防治小儿神经精神类疾病。王俊宏，女，教授，博士研究生导师，研究方向：中医药治疗小儿神经精神疾病。

前言

注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactive disorder, ADHD)是儿童青少年时期常见的一种早发性、持续性神经行为发育障碍疾病，其病程多持续6个月以上，可从儿童青少年时期持续至成人，其核心症状主要表现为与患儿年龄、发育水平和智力预期不符的注意力不集中、多动和冲动[1-2],该病在世界范围内的患病率平均在5%左右[3],在中国约为5.5%[4]。ADHD的发病机制目前尚不明确，且往往以共患一种或多种其他神经精神障碍或其他系统性疾病的形式发病，严重影响了该病的临床诊断和治疗[5]。临床中，常见ADHD患儿合并胃肠疾病，但在既往的研究中并没有引起重视，主要原因可能在于ADHD患儿的胃肠道症状相比于精神行为问题较为轻微，且胃肠道功能障碍在儿童中普遍存在，也导致了其容易被忽略。本文基于现代医学的脑肠轴理论以及中医学脾脑相关理论，采用SHR大鼠作为ADHD动物模型，研究ADHD的胃肠道功能问题以及脑肠肽参与ADHD发病的潜在机制。

1 材料

1.1 动物
4周龄SPF级雄性SHR大鼠50只，同周龄雄性Wistar大鼠10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006,动物饲养于北京中医药大学北京中医药研究院动物实验室SPF级动物房，使用许可证号：SYXK(京)2020-0033。本实验获北京中医药大学实验动物伦理委员会审批，审批号：BUCM-2020121401-4114。实验过程中动物可自由摄食和饮水，室温(25±2) ℃,环境湿度(50±5)%,每日光照时间 12 h, 饲养6周。
1.2 药物及试剂
静宁颗粒(中药配方颗粒，处方组成：太子参、熟地黄、枸杞子、五味子、石菖蒲、远志、茯苓，北京康仁堂药业有限公司);盐酸托莫西汀胶囊(规格：25 mg, 美国礼来公司，产品批号：D211636)。大鼠胃泌素(gastrin, Gas)、胃动素(motilin, MTL)、饥饿素(ghrelin, GHRL)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、P物质(substance P,SP)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：E-EL-R0472c、E-EL-R0639c、 E-EL-R0842c、E-EL-R1062c、E-EL-0067c)。
1.3 仪器
离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司，型号：AXTGL16M);酶标仪(美国Bio-Rad公司，型号：550)。

2 方法

2.1 动物分组及给药
自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats, SHR)在10周龄前无高血压的相关症状，而在4～10周龄之间表现出ADHD的典型症状，且其神经生物及生化代谢机制和ADHD有共通性，是ADHD的理想实验动物模型[6-7]。实验开始前，4周龄SPF级雄性SHR大鼠50只饲养于屏障动物环境，适应性喂养3 d后称其质量并编号，按照随机数字表法分为静宁颗粒高、中、低剂量组及盐酸托莫西汀组和模型组，每组10只；10只同周龄雄性Wistar大鼠为空白组。根据人与大鼠等效剂量系数换算出大鼠每单位体质量的日给生药量，大鼠的日给药体积为10 mL·kg-1,以去离子水配制静宁颗粒高、中、低剂量组的生药浓度分别为3.0 g·mL-1、1.5 g·mL-1、0.75 g·mL-1(每次给药前配制),即静宁颗粒高、中、低剂量组大鼠的日给药量为30 g·kg-1、15 g·kg-1、7.5 g·kg-1;盐酸托莫西汀药液浓度为0.536 g·mL-1,即盐酸托莫西汀组大鼠的日给药量为5.36 mg·kg-1。各组大鼠给予相应药物灌胃，空白组及模型组给予去离子水灌胃，每日1次，给药6周，每日观察各组大鼠的毛色、精神和活动状态。
2.2 胃内容物残留率和小肠推进率
第43天上午8时开始取材，提前12 h禁食不禁水，称量大鼠体质量，予新鲜配制的炭末混悬液(10%阿拉伯胶+10%活性炭)2 mL灌胃，15 min后采用浓度10%的水合氯醛，按体质量3.5 mL·kg-1剂量腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血3～5 mL,3 000 r·min-1离心10 min后血清分装于0.5 mL冻存管中。结扎胃贲门及幽门，剪取胃，拭干后称取全胃质量，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后再次拭干，称取胃净质量，计算胃内容物残留率。自盲肠处截取小肠，自然平铺于桌面，测量小肠全长以及炭末混悬液从幽门推向小肠末端的距离，计算小肠推进率。
胃内容物残留率= [(胃全重-胃净重)/炭末混悬液质量]×100%
小肠推进率= (炭末推进长度/小肠长度)×100%
2.3 旷场实验
实验第5周白天灌胃后，9～17时对大鼠进行旷场实验，在100 cm×100 cm 实验箱底中心划定50 cm×50 cm为中心区域，中心区域以外为周围区域。采用Super Maze动物行为视频分析软件记录大鼠运动总路程和总静止时间以及在中心区域和周围区域的运动时间，每只大鼠开始实验前均用医用酒精喷洒箱体并擦拭，以避免残留气味对实验结果的影响。
2.4 脑肠肽测定
采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定大鼠血清Gas、MTL、GHRL、VIP、SP水平。严格参照 ELISA 试剂盒操作步骤操作，最终用酶标仪测量各孔的OD值，根据标准曲线计算样本的实际浓度。
2.5 统计学方法
采用SPSS 25.0统计分析软件对实验数据进行统计分析，计量资料以平均值±标准差(x¯±s)表示，多组间数据比较采用单因素方差分析；多重比较采用LSD(方差齐时)或Games-Howell检验(方差不齐时),P<0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较
各组大鼠均未出现死亡，且各组大鼠的毛色以及精神状态未见明显差别，但静宁颗粒低剂量组及模型组大鼠较其他各组大鼠明显活泼好动。
3.2 各组大鼠旷场实验结果比较
从大鼠旷场运动轨迹发现，空白组大鼠运动方式单一，路线规则清晰，主要沿箱体边缘运动，且总体运动路径较短；模型组大鼠运动路线复杂，杂乱无章，多次穿越中心区域，少有与箱体边缘平行的运动路线；各治疗组大鼠运动路线较模型组均有不同程度的改善，主要表现为中心区域运动减少，周围区域运动时间增加，路线更为规整，与空白组大鼠的运动路线更为相似。见图1。数据统计分析发现，与空白组比较，模型组大鼠运动总路程明显延长(P<0.05),静止时间明显缩短(P<0.05),中心区域运动时间明显延长(P<0.05),周围区域运动时间明显缩短(P<0.05);与模型组比较，各给药组大鼠运动总路程明显缩短(P<0.05),静止时间明显延长(P<0.05),中心区域运动时间明显缩短(P<0.05),周围区域运动时间明显延长(P<0.05);与静宁颗粒高剂量组比较，静宁颗粒中、低剂量组大鼠运动总路程明显延长(P<0.05),静止时间明显缩短(P<0.05),中心区域运动时间明显增加(P<0.05),周围区域运动时间明显缩短(P<0.05);与盐酸托莫西汀组比较，静宁颗粒低剂量组大鼠中心区域运动时间明显增加(P<0.05),周围区域运动时间明显缩短(P<0.05)。见表1。表1 各组大鼠旷场实验活动情况比较(x¯±s)注：与模型组比较，*P<0.05;与静宁颗粒高剂量组比较，#P<0.05;与盐酸托莫西汀组比较，△P<0.05
3.3 各组大鼠胃内容物残留率及小肠推进率比较
与空白组比较，模型组大鼠胃内容物残留率明显升高(P<0.05),小肠推进率明显降低(P<0.05)。与模型组比较，静宁颗粒高、中剂量组大鼠胃内容物残留率明显降低(P<0.05),小肠推进率明显升高(P<0.05);静宁颗粒低剂量组大鼠胃内容物残留率及小肠推进率无明显差异(P>0.05)。见表2。
3.4 各组大鼠血清脑肠肽水平比较
与空白组比较，模型组大鼠血清GAS、MTL、Ghrelin、SP水平明显降低(P<0.05),血清VIP水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较，各干预组大鼠血清MTL、Ghrelin水平明显升高(P<0.05),VIP水平明显降低(P<0.05);静宁颗粒高、中剂量组大鼠血清GAS、SP水平明显升高(P<0.05)。与盐酸托莫西汀组比较，静宁颗粒高、低剂量组大鼠血清GAS、MTL、VIP水平明显降低(P<0.05);静宁颗粒高剂量组大鼠血清Ghrelin水平明显升高(P<0.05);静宁颗粒低剂量组大鼠血清SP水平明显降低(P<0.05)。见表3。表2 各组大鼠胃内容物残留率和小肠推进率比较(x¯±s)
注：与模型组比较，*P< 0.05;与静宁颗粒高剂量组比较，#P< 0.05;与盐酸托莫西汀组相比，△P<0.05图1 大鼠旷场运动轨迹图表3 大鼠血清GAS、MTL、Ghrelin、VIP、SP水平比较
注：与模型组比较，*P<0.05;与静宁颗粒高剂量组比较，#P<0.05;与盐酸托莫西汀组比较△P<0.05

4 讨论

本实验结果显示，SHR大鼠较好地模拟了ADHD多动、冲动、好动而少静的运动特点，在经静宁颗粒和盐酸托莫西汀治疗6周后，其在中心区域运动时间及运动总路程等显著下降。胃内容物残留率和小肠推进率常用来评价实验动物的胃肠动力，间接反映其胃肠蠕动、排空等运动功能[8]。本项实验中，模型组胃内容物残留率显著高于空白组，而小肠推进率显著低于空白组，表明模型组SHR大鼠在胃肠排空动力方面存在明显的功能障碍，经药物干预后，两项指标均有所改善，尤以静宁颗粒高剂量组、静宁颗粒中剂量组和盐酸托莫西汀组作用显著，静宁颗粒和盐酸托莫西汀对SHR大鼠的胃肠功能均有调节作用。脑肠肽水平测定结果也显示模型组大鼠较空白组均存在显著差异，静宁颗粒和盐酸托莫西汀对GAS、MTL、Ghrelin、VIP和P物质均有显著调节作用。
脑肠肽既是调节胃肠道功能的关键激素，也是神经系统重要的神经递质，GAS、MTL、Ghrelin、VIP和P物质是其中最为常见且研究较多的几种。GAS是由胃和十二指肠的G细胞分泌的一种多肽，可以通过结合胃肠道的相应受体发挥促胃酸分泌和黏膜增殖的作用[9]。同时，在中枢神经系统中，GAS胆囊收缩素B受体和多巴胺D1受体存在关联机制，GAS/CCK介导的信号转导上调以及参与多巴胺能奖励系统、调节HPA轴[10-11]功能可能是GAS参与ADHD发病的潜在机制。MTL由小肠Mo细胞分泌，通过调节胃肠移行性运动复合波(特别是迁移运动复合体的胃期Ⅲ相)发挥胃肠收缩以及促进食欲和胰岛素分泌的作用，MTL及其受体激动剂红霉素具有抗焦虑作用[12],MTL基因多态性与抑郁症患病率相关[13],提示MTL有可能参与影响ADHD的情绪、认知功能。Ghrelin由胃底X/A样细胞分泌，其生理功能包括刺激食欲、促GH分泌以及调节肠蠕动、觉醒节律、味觉以及参与调节葡萄糖代谢等[14],其基因多态性已被证实为ADHD发病的危险因素[15],同时Ghrelin可以调节冲动反应以及DA和5-HT水平[16]。VIP由中枢神经系统和胰岛D1细胞分泌，可以舒张胃肠平滑肌及血管并刺激腺体分泌[17]。SP主要来源于神经组织，通过结合神经激肽1受体介导痛觉的产生，与肠蠕动以及炎症的发生具有密切关系[18]。VIP水平的降低和SP水平升高有益于胃肠的有效收缩从而改善便秘情况[19-20]。VIP相关的基因超表达可以增加动物的攻击性行为[21],SP优先神经激肽1受体的缺乏则会导致小鼠出现类似ADHD的注意力缺陷和多动、冲动症状[22]。
ADHD属于中医“脏躁”“健忘”疾病范畴，其根本病机在于阴虚阳亢，是以脑为主导的“五神藏”功能紊乱所引起的疾病[23]。临床中，ADHD患儿常伴随厌食、挑食、早饱、便秘等胃肠道问题[24]。静宁颗粒以益气养阴立法，同时顾护脾胃，由太子参、熟地黄、枸杞子、五味子、远志、石菖蒲、茯苓组成，太子参健脾益气，养阴生津，为诸参中清补之品，“功媲大参”;熟地黄滋肾养阴，填补先天，二者共为君药，有气阴双补、益气安神、填精益智之效。枸杞子补益肝肾，交通心肾；五味子为“生津之要药，收敛之妙剂”,可以益精敛神，“补虚劳，益气强阴”,二者共为臣药，以助君药之力。远志“利九窍，益智慧”,安神定志；石菖蒲“补五脏，通九窍”,宁神开窍；茯苓健脾安神，三者共为佐使。诸药合用，益气养阴，健脾益肾，安神定志[25],既能治疗 ADHD的核心症状，同时对胃肠功能也有较好的改善作用。
本项实验研究表明，ADHD存在一定程度的胃肠功能障碍，静宁颗粒和盐酸托莫西汀在改善ADHD核心症状的同时，对其胃肠功能也具有显著的调节作用。一方面可能是通过调节脑肠肽水平实现，另一方面则可能源于脑肠肽通过特定的机制也参与到了ADHD的发病中。脾为后天之本，“脾藏营，营舍意”,运化水谷精微为机体活动提供物质基础，脾的功能失常可导致ADHD的发生[26],这也提示从脾脑相关理论出发，从脾论治ADHD也是中医临床的治疗思路之一。既往研究认为，盐酸托莫西汀会引起ADHD的胃肠道症状[27],但在本研究中却显示盐酸托莫西汀对ADHD的胃肠功能也具有改善作用，这也提示胃肠道问题可能是ADHD本身存在且较早出现的并发症状之一，尚需要进一步的临床试验进行验证。
综上，静宁颗粒不仅可以治疗ADHD的核心症状，对胃肠功能也起到较好的改善作用，其作用效果与盐酸托莫西汀大致相当。胃肠功能异常与ADHD的关系以及脑肠肽在其发病中的作用需要临床研究以及更深入的机制探索。

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