粪菌移植疗法MTT可长期改善孤独症儿童肠道菌群

简介：美国亚利桑那州立大学的研究团队通过宏基因组测序发现，孤独症儿童肠道菌群一些重要代谢功能如硫代谢和氧化应激保护功能水平降低，部分肠道有益菌和常见菌含量下降。而在经过10周的微生物群移植治疗和两年的观察期后，孤独症儿童肠道菌群的功能与组成得到了显著且持续的改善。该项研究成果于日前发表在《国际分子科学杂志》（International Journal of Molecular Sciences）上。

1. 研究背景

粪菌移植是指将健康人粪便中的功能菌群移植到患者肠道中，使患者重新建立肠道菌群，从而达到改善肠道菌群失调和治疗肠道及相关疾病的目的。

微生物群移植疗法（Microbiota Transfer Therapy, MTT）是一种加强版的粪菌移植疗法，其通过在粪菌移植前辅以肠道杀菌和肠道清洁等措施从而加强粪菌移植的效果。

孤独症儿童普遍伴随胃肠道症状和肠道菌群失调。2016年，美国亚利桑那州立大学Rosa Krajmalnik-Brown团队对18名伴有胃肠道症状的孤独症儿童开展了约10周的MTT治疗，并在MTT治疗结束8周后和2年后进行追访。发现经MTT治疗后，孤独症儿童的核心症状、异常行为表现及胃肠道症状较治疗前均得到显著且稳定的改善，效果持续时间可长达两年；

同时，16S rRNA测序结果显示，孤独症儿童的肠道菌群结构在MTT治疗结束后的两年间持续得到改善，α多样性不断提高，双歧杆菌、普雷沃氏菌等肠道常见菌属的相对丰度在MTT治疗结束两年后仍较治疗前有明显提升[1,2]。以上结果提示，MTT治疗对患儿的孤独症症状、胃肠道症状和肠道菌群失调具有长期改善效果。（可参阅公众号文章：菌群移植治疗孤独症具有长效性 ）

今年，该研究团队对前期18名孤独症儿童的粪便样本展开宏基因组测序，深入分析了孤独症儿童在MTT治疗开始前、MTT治疗结束时和MTT治疗结束两年后肠道菌群组成变化以及肠道菌群功能差异，发现MTT治疗可显著且持续地改善孤独症儿童肠道菌群的组成与功能[3]。

2. 研究方法

本项研究共招募18名7-16岁的伴有胃肠道症状的孤独症儿童和20名年龄性别相匹配的健康儿童，均取粪便样本进行肠道菌群宏基因组测序后，孤独症儿童共开展为期10周的微生物群移植治疗（MTT），健康儿童不做干预。

孤独症儿童首先须服用2周的万古霉素进行肠道杀菌，并在杀菌完成后服用肠道清洁剂Moviprep以去除万古霉素和剩余的细菌；然后进行1-2天的高剂量粪菌移植（每日移植剂量为2.5×1012个细菌，口服胶囊或直肠给药）和为期8周的常规剂量粪菌移植（每日移植剂量为2.5×109个细菌，口服胶囊）。所移植的粪菌为标准化制备的人肠道菌群冻干粉，孤独症儿童在粪菌移植期间同时服用胃酸抑制剂奥美拉唑以提高细菌在肠道中的成活率和定植水平。分别在粪菌移植完成时（即MTT治疗结束时）和MTT治疗结束2年后，取受试孤独症儿童的粪便样本开展肠道菌群宏基因组测序。

3. MTT改善孤独症儿童的肠道菌群组成

前期16S rRNA测序结果表明，孤独症儿童在结束MTT治疗两年后，肠道中双歧杆菌属、普雷沃氏菌属、脱硫弧菌属这三个肠道常见菌属的相对丰度仍较治疗前有明显提升。研究人员继而从菌种的角度对孤独症儿童肠道中上述三个菌属以及其他肠道常见菌的丰度开展了进一步探究与验证。

1）MTT可提高孤独症儿童肠道中普雷沃氏菌和双歧杆菌的水平

双歧杆菌是肠道中常见的有益菌，不仅具有改善肠道消化吸收的作用，还可作为生物屏障抑制肠道中致病菌的生长，从而减轻和预防肠道感染。

普雷沃氏菌属于肠道常见菌，可分解多糖和膳食纤维并产生短链脂肪酸，促进植物性饮食的消化吸收，在肠道中起到一定的主导作用。脱硫弧菌相关内容将在下一小节中加以阐述。

研究人员基于宏基因组测序数据分析了孤独症儿童和健康儿童肠道中2种双歧杆菌和8种普雷沃氏菌的相对丰度差异。结果显示，孤独症儿童肠道中这10个菌种的相对丰度在开展MTT治疗前均明显低于健康儿童，在MTT治疗结束时均得到显著提升，并在MTT治疗结束两年后仍较治疗前有明显提升。

提示孤独症儿童肠道中缺少双歧杆菌和普雷沃氏菌，而MTT治疗可有效提高并持续改善孤独症儿童肠道中双歧杆菌和普雷沃氏菌的水平。

2）MTT可提高孤独症儿童肠道中的阴道乳杆菌的水平并降低孤独症相关细菌芬氏另枝杆菌的水平

在人的口腔、肠道和阴道中，有一类能够分解糖类物质产生大量乳酸的细菌——乳酸菌，它能维持所定植器官的酸性环境，从而抑制有害菌的生长。其中一种乳酸菌——阴道乳杆菌（Lactobacillus vaginalis）可在孕妇生产时由母亲产道定植到新生儿肠道中，成为新生儿肠道菌群的有益组分之一，继而起到保护儿童肠道健康、提高儿童消化吸收能力和自身免疫力和作用。

宏基因组数据表明，孤独症儿童在MTT治疗前肠道中阴道乳杆菌的相对丰度显著低于健康儿童；在10周的MTT治疗结束时，孤独症儿童肠道中阴道乳杆菌的相对丰度显著提高，并与健康儿童水平持平；而在MTT治疗结束两年后，孤独症儿童肠道中阴道乳杆菌的相对丰度仍较MTT治疗前有所提升。这提示孤独症儿童肠道中缺少阴道乳杆菌，而MTT可有效提高并持续改善孤独症儿童肠道中阴道乳杆菌的水平。

芬氏另枝杆菌（Alistipes finegoldii）是一种与孤独症发病相关的肠道细菌。该菌可表达分解色氨酸的色氨酸酶，易造成肠道中色氨酸水平降低，继而可导致肠道中5-羟色胺等须依赖色氨酸而合成的神经递质明显减少。目前已在焦虑症和抑郁症患者的肠道菌群中观察到芬氏另枝杆菌水平的异常升高，并发现该菌与孤独症的发病相关。

宏基因组分析结果显示，孤独症儿童在MTT治疗前肠道中芬氏另枝杆菌的相对丰度稍高于健康儿童；而在MTT治疗结束时和结束两年后，孤独症儿童肠道中芬氏另枝杆菌的相对丰度均显著低于治疗前水平，且表现出持续降低的趋势。这提示MTT治疗可显著且持续地降低孤独症儿童肠道中芬氏另枝杆菌的水平。

3）MTT可使孤独症儿童肠道中的脱硫弧菌维持在高水平

脱硫弧菌也属于肠道常见菌属，可将肠道中的硫酸盐还原为硫化氢。小剂量硫化氢对调节肠道内环境和肠粘膜功能起到重要生理作用，并参与对许多消化系统疾病的自然预防。同时，脱硫弧菌在肠道中还与产丁酸菌等有益菌存在共生关系，从而可提高肠道中丁酸的产量，间接地起到保护肠道上皮屏障等作用。

但较大剂量的硫化氢对肠道上皮细胞有毒，易引发肠道敏感性增加、肠漏、腹痛、溃疡性结肠炎等不良反应。因此，肠道中脱硫弧菌过多也会对肠道健康起到负面影响。

研究人员借助宏基因组测序对肠道中最主要的一种脱硫弧菌Desulfovibrio piger展开分析，发现孤独症儿童在接受MTT治疗前肠道中该菌的相对丰度与健康儿童非常相近、没有明显差异；而在MTT治疗结束时和结束两年后，孤独症儿童肠道中该菌的相对丰度较治疗前、健康儿童水平均有明显升高。提示孤独症儿童肠道中脱硫弧菌水平与健康儿童并无二致，而MTT治疗可显著增加孤独症儿童肠道中的脱硫弧菌，并使其持续维持在较高水平。同时也提示医务人员须关注孤独症儿童在MTT后可能出现的肠道中脱硫弧菌水平过高的问题以及可能由此引发的肠道不适和不良反应。

4. MTT改善孤独症儿童肠道菌群的代谢功能

宏基因组KO富集分析表明，孤独症儿童肠道菌群的代谢功能发生改变，表现为菌群中一些行使重要代谢功能的基因的相对丰度出现变化，而MTT治疗可改善孤独症儿童肠道菌群的代谢功能异常，使其接近健康儿童水平。

1）MTT可改善孤独症儿童肠道菌群的硫代谢和硫酸化代谢功能

硫元素参与人体多项代谢过程。食物中的硫元素部分以硫酸盐的形式存在，难以在肠道中被人体直接吸收和利用。在肠道细菌的代谢作用下，肠道中的硫酸盐可经中间产物APS（腺苷酰硫酸）转化为活性硫酸根PAPS（3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸），继而可被人体吸收、参与体内多种硫酸化代谢反应。

APS向PAPS的活化转换是可逆的，即部分肠道细菌具有将PAPS失活为APS的功能。宏基因组代谢通路分析表明，该项失活功能在孤独症儿童的肠道菌群中明显提高，易造成孤独症儿童体内硫酸化代谢功能降低。本公众号在2022年10月8日的推文中也提到过孤独症儿童普遍存在硫酸化代谢功能障碍。全文参考：孤独症中高血清素血症与硫酸化代谢功能障碍的关系https://mp.weixin.qq.com/s/ezGfuBxdW6BTavK-aoisAg

APS和PAPS还可经肠道菌群代谢为亚硫酸盐，继而被还原为硫化物，从而参与半胱氨酸、甲硫氨酸和谷胱甘肽的合成及抗氧化机制。分析表明，APS向亚硫酸盐转换的功能在孤独症儿童肠道菌群中显著降低，即肠道菌群的硫代谢功能明显降低，提示孤独症儿童体内相关代谢过程可能受影响。

上述结果提示，孤独症儿童肠道菌群的硫代谢和硫酸化代谢功能均出现受阻。而在MTT治疗结束时和结束两年后，孤独症儿童肠道菌群PAPS失活功能过强以及APS向亚硫酸盐转换过弱的情况均得到了显著且持续的改善，表明MTT可提高孤独症儿童肠道菌群的硫代谢和硫酸化代谢功能，同时提示MTT治疗具有改善和提高孤独症儿童体内硫代谢及硫酸化代谢功能的潜力。

2）MTT可提高孤独症儿童肠道菌群的氧化应激保护功能

肠道在遇到感染、毒素等不利条件下会大量产生和积累活性氧。活性氧会对细胞的结构和功能造成严重损害，尤其是会损伤细胞中的线粒体、蛋白质和DNA，引发细胞凋亡。这种现象被称为氧化应激。

一些肠道细菌可表达甲硫氨酸硫氧化物还原酶A（msrA）和超氧化物还原酶（SOR）。部分蛋白质中含有的甲硫氨酸易被活性氧氧化，使得蛋白质失去活性和功能。msrA酶可保护这些蛋白免受氧化，恢复受损蛋白的活性和功能，减轻氧化应激损伤。此外，活性氧种类之一的超氧化物可被SOR酶还原为过氧化氢，进而再被代谢为水，失去毒性。简言之，肠道菌群具有减轻肠道氧化应激损伤的功能，起到保护肠道和机体健康的作用。

宏基因组测序结果显示，孤独症儿童肠道菌群中msrA酶和SOR酶基因的相对丰度明显低于健康儿童，而在MTT治疗结束时和结束两年后，两种基因的相对丰度可见显著提升。这提示孤独症儿童肠道菌群的抗氧化损伤能力下降，而MTT治疗可有效提高肠道菌群的氧化应激保护功能，减轻孤独症儿童肠道及机体的氧化应激损伤。

3）MTT可提高孤独症儿童肠道菌群合成维生素B12和核苷酸的功能

维生素B12具有促进神经系统发育和神经损伤修复的作用，有研究发现孤独症的发病与体内维生素B12的减少有关。缺少维生素B12还会降低体内叶酸的利用率、降低叶酸生物合成相关酶的活性，从而导致核酸合成的原料——核苷酸的生成减少。

宏基因组测序结果表明，在孤独症儿童肠道菌群中，四吡咯甲基化酶和叶酸依赖的核糖胸苷合成酶的基因相对丰度均显著低于健康儿童，前者是催化维生素B12合成的关键酶，后者负责胸腺嘧啶核糖核苷的合成。提示孤独症儿童肠道菌群合成维生素B12和核苷酸的功能显著下降。这可能会影响儿童体内核酸的合成，并与孤独症儿童并发贫血有关。

孤独症儿童在经过MTT治疗后，肠道菌群中四吡咯甲基化酶和叶酸依赖的核糖胸苷合成酶的基因相对丰度均显著提高，并且在MTT治疗结束两年后依然较治疗前有所改善，提示MTT治疗可提高孤独症儿童肠道菌群的维生素B12合成功能以及核苷酸合成功能。

4）MTT可提高孤独症儿童肠道菌群的油酸合成功能

油酸，又称ω-9脂肪酸，具有降低血脂、减轻炎症的功能，起到保护心脑血管、改善情绪与认知的作用。

测序分析发现，在MTT治疗前，孤独症儿童肠道菌群中主导油酸合成的油酸水合酶的基因相对丰度显著低于健康儿童；而在MTT治疗结束时和结束两年后，孤独症儿童肠道菌群中该酶基因的相对丰度较治疗前有显著提高。提示孤独症儿童肠道菌群的油酸合成能力下降，而MTT治疗可显著提升并有效维持孤独症儿童肠道菌群的油酸合成功能。

5. 小结

宏基因组测序发现，孤独症儿童肠道菌群一些重要代谢功能如硫代谢和氧化应激保护功能水平降低，部分肠道有益菌和常见菌含量下降。

经过10周的微生物群移植治疗和两年的观察期后，孤独症儿童肠道菌群的功能与组成得到了显著且持续的改善。包括：

①提高了孤独症儿童肠道中有益菌（双歧杆菌和乳杆菌）和常见菌（普雷沃氏菌和脱硫弧菌）含量，并降低了孤独症发病相关细菌（芬氏另枝杆菌）的含量；

②提高了孤独症儿童肠道菌群的硫代谢/硫酸化代谢功能、氧化应激保护功能以及合成维生素B12、核苷酸和油酸的功能。

参考文献：

[1] Kang DW, Adams JB, Gregory AC, et al. Microbiota transfer therapy alters gut ecosystem and improves gastrointestinal and autism symptoms: an open-label study. Microbiome, 2017, 5(1): 10.

[2] Kang DW, Adams JB, Coleman DM, et al. Long-term benefit of microbiota transfer therapy on autism symptoms and gut microbiota. Scientific Reports, 9(1): 5821.

[3] Nirmalkar K, Qureshi F, Kang DW, et al. Shotgun metagenomics study suggests alteration in sulfur metabolism and oxidative stress in children with autism and improvement after microbiota transfer therapy. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(21): 13481.