Cell：孤独症发病机制新发现——孤独症风险基因可扰乱皮层神经环路的特定发育模式

脑皮层回路主要由锥体神经元（PN)相互连接形成神经环路，但它们在胚胎发育过程中的“组装”尚不清楚。近期瑞士巴塞尔大学Botond Roska课题组在Cell发表了一篇相关文章“Pyramidal neurons form active, transient, multilayered circuits perturbed by autism-associated mutations at the inception of neocortex”。

文章使用单细胞测序的方法，发现小鼠胚胎Rbp4-Cre皮层神经元，在转录组上最接近第5层锥体神经元，在体内显示两个阶段的回路组装。在E14.5阶段，它们形成了一个多层的回路模体，仅由胚胎的近投射型神经元组成。到E17.5时，这过渡到第二个模体，涉及所有三种胚胎类型，类似于三个成人的第5层类型。体内膜片钳记录和双光子钙成像揭示神经元在胚胎发育过程形成功能性突触。孤独症（自闭症）相关风险基因过表达会扰乱Rbp4-Cre神经元发育，并在皮层中形成紊乱的斑块。

总之，本研究发现锥体神经元在新皮层开始时就形成了活跃的瞬时多层回路，而自闭症相关风险基因表达扰乱皮层的发育，研究这些回路可以对自闭症的发病机制寻求新的治疗方向。

01.Rbp4-Cre神经元形成，由不同细胞类型填充的瞬态层

在胚胎发育过程中，Rbp4-Cre神经元在转录组学上最接近大脑皮层第5层的锥体神经元，为了揭示Rbp4-Cre神经元的位置，每天收集从E13.5到E18.5的脑切片，并用GFP抗体对其进行染色。在胚胎期E14.5，Rbp4-Cre神经元形成两个不同的层：靠近皮层表面的短暂性浅层和皮层下的深层结构。浅层Rbp4-Cre神经元出现凋亡，其数量随着时间的推移而减少，所有浅层神经元在E17.5之前消失（图1）。

在E14.5，表层和深层主要由near-projecting神经元与皮层表面平行。在E18.5期Rbp4-Cre 神经元浅层结构消失，深层结构中near-projecting神经元延伸的树突主要垂直于皮层表面，同时也存在IT神经元、PT神经元。

图1：Rbp4-Cre神经元胚胎期发育的结构特征

02.Rbp4-Cre神经元表现出两个阶段的活性增加

Roska及其研究团队设计了一种手术方案：胚胎被固定在母体腹腔内充满琼脂的三维保持装置内，可以维持正常的胚胎血流和温度，这些改进允许对Rbp4-Cre神经元进行至少5小时的成像，其分辨率足以解析单个神经突。研究人员利用该技术进一步观察胚胎期Rbp4-Cre 神经元活性变化，结果发现在Rbp4-Cre神经元胞体和树突中，自发钙活性从E13.5到E14.5显著增加，从E14.5到E15.5期间显著下降，在E15.5到E16.5期间维持低水平，在E16.5到E17.5期间钙活性明显升高（图2）。

图2：Rbp4-Cre神经元的体细胞（A）和神经突（B）中的自发钙活性

在胚胎期Rbp4-Cre神经元活动增加的第一阶段，胞体和树突之间的活性无显著差异。此外，浅层和深层的神经元均处于活跃状态。相比之下在活性增加第二阶段树突比胞体表现出明显更高活性。在胚胎发育过程中，Rbp4-Cre 神经元以时间协调的方式切换其活动、空间组织和细胞类型身份。进一步通过E12.5期间电转入向内整流钾通道Kir2.1，引起Rbp4-Cre神经元超极化后，这些神经元后续迁移到皮层浅表层。

03.Rbp4-Cre神经元在胚胎发育过程中形成功能性突触

免疫荧光实验发现胚胎期Rbp4-Cre神经元表达突触标志物Snap25和 PSD-95，电子显微镜也观察到存在完整的突触结构，表明在E14.5期间Rbp4-Cre神经元已经形成活性的神经连接。

在从Rbp4-Cre神经元成像时应用突触传递的激动剂（AMPA和NMDA的混合物），紧随其后的是所有成像的Rbp4-Cre神经元中钙活性显著增加。此外，体内双光子靶向膜片钳检测到Rbp4-Cre神经元的E14.5和E18.5处的自发兴奋性突触电位的存在。表明Rbp4-Cre神经元在胚胎发育过程中形成功能性突触。

图3：E14.5期间Rbp4-Cre神经元形成功能性突触

04.自闭症风险基因扰乱Rbp4-Cre神经元发育

神经发育障碍与皮层环路功能障碍有关，因此研究人员通过转录组学分析发现精神分裂症和自闭症相关的风险基因在胚胎期Rbp4-Cre神经元表达上调。通过构建自闭症相关的风险基因Chd8 或Grin2b突变小鼠，发现这些突变小鼠Rbp4-Cre神经元发育期的层次结构和活性状态改变，并从E16.5开始发现了紊乱的斑块，这种形式的局部紊乱斑块让人想起在自闭症儿童皮质中观察到的紊乱斑块（图4）。

图4：自闭症风险基因扰乱Rbp4-Cre神经元发育

05.结 论

本研究发现神经元在胚胎发育过程存在明显层次结构，其活性存在两种活性模式，并在发育过程中形成功能性突触，其自闭症风险基因突变后可扰乱第5层锥体神经元的发育特征，研究这些回路可以深入了解自闭症的病因。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.03.025

参考文献

Munz M, Bharioke A, Kosche G, Moreno-Juan V, Brignall A, Rodrigues TM, Graff-Meyer A, Ulmer T, Haeuselmann S, Pavlinic D, Ledergerber N, Gross-Scherf B, Rózsa B, Krol J, Picelli S, Cowan CS, Roska B. Pyramidal neurons form active, transient, multilayered circuits perturbed by autism-associated mutations at the inception of neocortex. Cell. 2023 Apr 9:S0092-8674(23)00299-4. doi: 10.1016/j.cell.2023.03.025. Epub ahead of print. PMID: 37071993.

编译作者：雷子（brainnews创作团队）

校审：Simon（brainnews编辑部）