不明原因的癫痫和智力障碍/发育迟缓患儿的临床及相关致病基因分析

王文玉，戴园园
(徐州医科大学附属医院儿科，徐州221000)

关键词：癫痫；智力障碍；发育迟缓；基因突变；全外显子测序

摘要目的分析不明原因的癫和智力障碍/发育迟缓(E-ID/DD)患儿的临床特征及基因型特点。方法回顾性分析32例2017年1月至2020年12月徐州医科大学附属医院儿科通过高通量二代测序技术基因检测阳性的不明原因的E-ID/DD患儿临床资料。结果32例患儿中，男21例(65.6%)，女11例(34.4%)；癫首次发病年龄2日龄至11岁；E-ID/DD严重程度以中、重度为主(68.8％)；呈药物难治性癫(46.9%)。28/32例为基因突变，4/32例为基因拷贝数(CNVs)变异，主要涉及动作电位形成、突触传递、转录调节、信号传导，等。本研究共检测出22个基因突变，包括10个离子通道相关基因(SCN1A、SCN2A、SCN8A、KCNQ2、KCNT1、CACNA1A、CLIC2、CLCN4、GRIN2A、ATP1A3)，2个转录相关基因(ZMYND11、ATN1)，3个突触相关基因(DLG3、DLG4、CNKSR2)，2个细胞间相互作用基因(PCDH19、RELN)，2个酶相关基因(PPP2R5D、CDK13)，2个细胞功能相关基因(SHROOM4、CNNM2)，1个蛋白激活相关基因(OPHN1)。结论E-ID/DD临床表型呈多样性，离子通道基因变异最为常见；转录调控、细胞代谢、酶调节及细胞间相互作用等因素也可能参与E-ID/DD的共同发病机制。本研究发现了多个未报道致病性基因突变位点及CNVs变异，丰富了E-ID/DD患儿的基因型及表型。

癫痫是一种具有持久性的产生癞发作倾向为特征的慢性脑疾病，可由遗传、代谢、结构、免疫等不同病因所致。智力障碍/发育迟缓(intellectual/developmentaldisabilities，ID/DD)是一大类具有高度临床和遗传异质性的神经发育障碍疾病，是指18岁以前的一种功能性疾病，主要表现为不同程度智力低下和适应能力受限[1]。癫痫(epilepsy-ID/DD，E-ID/DD)两种疾病的病因复杂多样，多数原因尚不明确，给社会、家庭带来沉重负担。遗传因素是癞和ID/DD患儿的主要病因[2,3]。ID/DD是癫痫的主要共患病之一，癫痫在ID患者中的患病率约为22.2%[4]，且随着ID/DD的严重程度而加重。据报道，基因变异是癞和ID/DD的共同发病机制，这些基因虽涉及不同的途径[5,6]，但多数基因与癫痫相关离子通道有关[7,8]，然而，检测致病基因变异一直面临着挑战，近年来，随着基因检测的技术不断进步，尤其是高通量二代测序技术(next-generationsequencing，NGS)的发展，越来越多的E-ID/DD患者在基因组学上诊断出其病因。本研究将检测出遗传学异常的不明原因E-ID/DD患儿为研究对象，分析其临床表型及基因型，探讨其治疗、预后，为后续遗传咨询提供帮助。

1资料与方法

1.1研究对象

回顾性分析2017年1月至2020年12月徐州医科大学附属医院(我院)儿科/神经内科门诊或病房收治的不明原因的32例E-ID/DD患儿。对检测出致病基因患儿及家系成员的临床资料建档，包括：年龄、性别、脑电图(EEG)检查、头颅影像学检查、家族史、有关发作的相关资料(首次发作的年龄，发作的类型、频率，等)、发育量表得分情况、有无畸形、服药及药物控制情况。患儿均建立定期每3个月1次随访。
本研究获得我院伦理委员会批准，患儿监护人均签署知情同意书。

1.2纳入和排除标准

按诊断标准纳入：①ID/DD诊断标准采用Gesell发育诊断量表(GessellDevelopmentScale)或中国韦氏智力测验分别对0~4岁及5~17岁儿童进行测试，且评分<70分；②癞诊断符合2017年国际抗癫痫联盟(ILAE)诊断标准。排除标准：①明确的非遗传性致病因素(缺血缺氧性脑病、中毒、外伤，等)；②临床特征及遗传代谢筛查已知的遗传代谢病，如：线粒体病、苯丙酮尿症，等；③临床表型明确的单基因异常(结节性硬化等)；④病例资料不完整或失访。

1.3基因检测方法

采集患儿及父母外周血2mL，采用高通量二代全外显子芯片测序技术行全外显子测序(WES)，经数据分析后根据美国医学遗传学与基因组学学会(AmericanCollegeofMedicalGeneticsandGenomics，ACMG)评估基因变异分级[9]，同时对目标序列进行PCR后行Sanger测序验证父母及来源，部分患儿同时行全基因组测序(CMA)，1例患儿及其家系成员行家系动态基因突变检测[10]。采用双向荧光重复引物PCR(TP-PCR)和毛细管分析扩增技术检测基因重复序列扩增数，然后用标记全长减去引物碱基个数和重复区域侧翼碱基个数的特殊算法得到重复区域碱基数。本研究基因检测及结果分析由康圣达医学检验所完成。

2结果

2.1一般资料分析见表1、2。32例患者中，男21例(65.6%)，女11例(34.4%)，男女性别比为1.91∶1；ID/DD发生于癞痫前10例(31.2%)，ID/DD发生于癞痫后9例(28.1%)，无明显区别14例(43.8%)。ID/DD受损程度：轻度10例(31.2%)，中度15例(46.9%)，重度7例(21.9%)。6例患儿有特殊面容，包括眼距增宽、贯通掌、小头畸形等1种或多种表现，1例有双眼上翻、斜视，1例有先天性心脏病病史。

2.2家族史32例患儿中，4例患儿有癞痫家族史，其中2例患儿为兄弟关系，其父亲、堂叔、父亲的大伯均有癞痫病史；2例有智力障碍家族史。

2.3癫发作及EEG检查结果癞痫发病年龄：2日龄至11岁，其中0~11个月16例，1~3岁9例，4~11岁7例。癞痫发作形式：全面性强直-阵挛发作18例，热性惊厥9例，肌阵挛3例，痉挛发作4例；强直发作5例；局灶性发作12例，2种或2种以上发作形式18例。EEG：背景活动慢化4例；局部异常放电11例，广泛性及多灶性放电17例，其中高度失律5例。

2.4头颅影像学检查32例患儿均行头颅MRI检测，6例(18.8%)患儿有异常发现，包括脑室不对称1例、左侧海马异常信号1例、脑外间隙增宽1例、脑萎缩1例、小脑下垂1例及巨脑回1例。

2.5治疗及随访32例患儿予以抗癞痫药物(AEDs)治疗，单药可控制发作8例，其中7例单药使用左乙拉西坦，1例使用丙戊酸钠；其余24例患儿均予2种或2种以上AEDs，包括丙戊酸钠、托吡酯、左乙拉西坦、奥卡西平、拉莫三嗪、氯硝西泮、苯巴比妥、托吡酯，等。其中可控制发作9例，15例治疗无效；呈药物难治性癞痫比例46.9%；5例患儿行生酮饮食，1例患儿予迷走神经刺激术(VNS)后癞痫发作部分控制。经随访，32例患儿癞痫发作完全控制12例(37.5%)，部分控制6例(18.8%)，无效13例(40.6%)，1例患儿死亡。经积极AEDs治疗后，15例E-ID/DD较前明显改善(46.9%)。

2.6遗传学检测结果临床特征及遗传学分析见表1、2，图1~9。32例中有28例基因突变(表1)，4例CNVs异常(表2)；28例患儿中检测出22个突变基因，包括10个离子通道相关基因(SCN1A、SCN2A、SCN8A、KCNQ2、KCNT1、CACNA1A、CLIC2、CLCN4、GRIN2A、ATP1A3)，2个转录相关基因(ZMYND11、ATN1)，3个突触相关基因(DLG3、DLG4、CNKSR2)，2个细胞间相互作用基因(PCDH19、RELN)，2个酶相关基因(PPP2R5D、CDK13)，2个细胞功能相关基因(SHROOM4、CNNM2)，1个蛋白激活相关基因(OPHN1)。基因变异主要以氨基酸错义突变为主，其变异来源13/28例(46.4%)为新生突变，4/28例(14.3%)来源于父亲，10/28例(35.7%)来源于母亲，1/28例(3.6%)因缺乏父母其中一方Sanger测序未能明确变异来源。4例CNVs致病异常中，主要包括CNVs的缺失或重复所致病理性改变。28例基因突变中，经ACMG认证为致病性基因突变9例，可疑致病基因突变7例，临床意义不明10例。

3讨论

E-ID/DD作为儿童常见的神经系统疾病，其发作特点及共同的发病机制一直是国内外研究的热点，但业内仍对此类疾病的认识不足，随着基因检测技术的进步和不断开展，推进了遗传学病因诊断。新的基因诊断方法为描述病因特异性特征提供了机会，有助于更好地理解癞痫的共患病和预后。

本研究中共收集了10例致病性基因突变，致病基因中以离子通道基因变异最为常见。离子通道为成孔蛋白，对神经元的兴奋性和信号传导至关重要，离子通道的功能包括形成动作电位、门控离子通道及调解细胞体积以维持细胞内外电位平衡，等。28例基因变异中以Na+、K+通道变异最多，SCN1A基因变异最为常见，SCN1A基因是临床上最常见的癞痫性脑病相关基因，关系最为密切。其表型包括：家族性热性惊厥、全面性癞痫伴热性惊厥附加征及Dravert综合征。Dravert综合征患者中发病年龄越小，其预后越差[11]。本研究病例3存在SCN1A基因致病性突变，临床表现为6个月内癞痫起病、全面性强直-阵挛发作、热性惊厥、全面发育迟缓、药物难治性癞痫等，预后较差，最终诊断为Dravert综合征。SCN2A基因编码神经元电压门控Ⅱ型钠通道的α亚单位，其致病变异体是神经发育障碍最常见的原因之一，占所有癞痫性脑病的1%，其表型已扩展，包括一系列发育障碍：发育性和癞痫性脑病(developmentalandepilepticencephalopathy，DEE)，婴儿期癞痫伴移行性局灶性发作(epilepsyofinfancywithmigratingfocalseizures，EIMFS)，婴儿痉挛和Dravert综合征、阵发性共济失调、精神分裂症、自闭症谱系障碍(autisticspectrumdisorder，ASD)和智力障碍，伴或不伴癞痫发作[12,13]。本病例5检测出SCN2A新生未报道致病突变，其位点c.35212A>G发生基因点突变，表型为婴幼儿期发病、发育迟缓和癞痫发作，对钠通道阻滞剂的药物治疗敏感性欠佳，呈药物难治性癞痫。SCN8A基因编码神经元电压门控Ⅷ型钠通道的α亚单位，SCN8A的致病性变体与一系列癞痫表型相关，从罕见的良性家族性婴儿癞痫(benignfamilialneonatalseizures，BFIS)至严重的早发性发育性和癞痫性脑病。多项研究证实SCN8A主要引起DEE[14,15]，目前所述的大多数SCN8A致病DEE患者具有严重的表型，其特征为癞痫发病早且难以控制、严重智力障碍、运动障碍及预后差。本病例6表现为癞痫呈全面性强直阵挛、强直发作，重度全面性发育迟缓，呈药物难治性癞痫。本研究SCN8A变异患儿的临床表型与文献报道表型相似，丰富了该基因变异的基因型。

KCNQ2基因编码电压门控钾离子通道蛋白亚基Kv7.2，该蛋白在脑内神经元兴奋性调控中起重要作用，1998年在常染色体显性遗传的新生儿良性癞痫中首次发现KCNQ2变异体[16]。其相关疾病包括由KCNQ2杂合致病性变异引起的新生儿癞痫表型，临床特征范围从轻度KCNQ2相关良性家族性新生儿癞痫    (KCNQ2-BFNE)至重度KCNQ2相关新生儿癞痫性脑病(KCNQ2-NEE)[17]。本病例7和病例8患儿检测出致病性KCNQ2不同位点变异，病例7基因变异位点既往有病例报道[18]，临床特征为新生儿时期发病、全面性强直癞痫发作、严重精神发育迟滞、EEG呈高度失律等，与相关病例报道表型相似，患儿最终诊断为癞痫性脑病。CACNA1A基因编码电压门控CaV2.1(P/Q型)钙通道的成孔α1亚单位，在神经突触传递中发挥关键作用，异性增强皮质突触的兴奋性，控制钙诱导的神经递质囊泡胞吐作用。电压门控钙通道的选择性生物学功能由其特定的α1亚基决定，此亚基为钙电流的主要调节剂，CACNA1A基因在一个队列研究中首次被发现[19]。钙通道可引起多种神经系统疾病，可表现为偏瘫、癞痫、认知损害、偏头痛、小脑共济失调伴小脑萎缩，等[20]。本病例10检测出CACNA1A基因突变，临床症状为癞痫发作、眩晕、智力障碍，尚无共济失调症状，影像学检查未见小脑异常。Sanger测序示该患儿母亲也存在CACNA1A基因突变，虽母亲携带此突变，可能因受不完全外显性影响而无明显症状。此杂合突变有可能导致疾病的发生。Ohba等[21]报道c.5393C>T位点与发作性共济失调2型发病有关，表型为发育迟缓，尚未出现共济失调、偏瘫及影像学异常，与本病例10有重合表型。

PPP2R5D基因编码蛋白质PPP2R5D，是2A丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)亚单位家族B56的一种亚型，在基因转录、细胞分裂和生长以及肌肉收缩等发挥重要作用[22]。临床表型为智力障碍、自闭症、癞痫、语言发育迟缓以及眼、骨骼、内分泌、心脏和生殖器畸形等，该基因相关表型的ID/DD是一种由于PPP2R5D基因的从头突变而发生的疾病[23]。本病例14患儿的PPP2R5D基因c.752A>C位点新生变异，致蛋白质功能损伤，经ACMG评级为致病突变，患儿临床表现为出生后全面发育迟缓，眼距宽，头围大，1岁多出现癞痫发作，头颅MRI示左侧海马区异常信号，口服左乙拉西坦控制癞痫发作尚可。有研究报道2015至2017年以来，经全外显子测序已诊断出25例PPP2R5D相关发育障碍患者[22]。本研究PPP2R5D基因突变位点及临床表型与文献报道表型有部分交叉。CDK13是编码周期蛋白依赖激酶相关核苷酸序列，通过控制剪接调节子的磷酸化状态和活性参与基因表达的调节，调节细胞周期进程和基因表达的20种不同ATP依赖性丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的一部分[24]。CHDFIDD是一种由CDK13基因变异引起的新综合征，目前相关CDK13报道的病例较少，Bostwick等[25]总结多例CDK13变异患儿的临床表型及基因型，除先天性心脏病、神经发育异常、面容畸形外，还包括肾脏异常、脊柱和骶骨等异常变形。ATP1A3基因编码Na+/K+-ATPaseα3亚单位，在神经系统中广泛表达，对于建立维持细胞膜电位和离子平衡非常重要，其临床表型与患儿交替性偏瘫有关，与相关文献报道该基因突变有类似表型[26]。

本病例27和病例28为兄弟关系。病例27患儿，3岁时频繁癞痫发作、肌阵挛及共济失调，EEG呈背景活动慢化，8岁时出现智力障碍，予以丙戊酸钠、左乙拉西坦、卡马西平等多种药物治疗，癞痫发作控制尚可。病例28患儿，2.5岁同样出现癞痫发作，伴有智力障碍。患儿父亲30岁时出现严重共济失调、癞痫发作，其堂叔、堂弟均有癞痫病史。动态基因检测出病例27的ATN15号外显子在2个等位基因上的CAG重复次数分别为19和73；病例28的CAG重复次数分别为19和74；其父亲的ATN1基因5号外显子在2个等位基因上的CAG重复次数分别为11和63；表型正常的母亲分别为13和19；表型正常的爷爷分别为8和56。据此分析得出致病基因为ATN1，来源于爷爷，且3代人中的发病年龄逐代变小，临床症状逐代加重。ATN1基因编码主要在中枢神经系统和其他器官中表达的转录阻遏物，正常人CAG重复6~35次，致病性CAG重复可以在48~79次[27]，该基因与齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩疾病(DRPLA)有关，DRPLA是一种罕见的神经退行性疾病，临床特征为小脑性共济失调、肌阵挛性癞、舞蹈手足徐动症和痴呆，等[28]。本研究与已报道DRPLA病例表型部分重合[29]，但后续随访需观察有无其他表型出现及其他家系成员发病。

CNVs变异主要包括CNVs的重复和缺失。本病例29患儿chr9seq[GRCH37]dup(9)(p243p242)处重复3.67Mb，临床表现为头颅MRI正常，EEG异常，10月龄时患儿癞痫发作，发作时双眼上翻凝视，四肢发软，发育迟缓，语言及智力发育落后。(Xq21.32q22.1)缺失目前数据库无已知遗传综合征的相关报道，但是该缺失有文献病例报道，主要临床表征为精神发育迟滞、癞痫、智力障碍、行为异常、精细运动差，等[30,31]，本研究与已报道病例表型部分重合。arr[hg19]4q28.1q32.1(128,604,350-156,915,362)片段重复28.32Mb，临床表型为双眼斜视、EEG异常、癞痫发作、语言及智力重度发育障碍，该片段重复已有文献病例报道，报道的病例主要表现为先天性膈疝[32]，丰富了此段CNVs变异的表型。

综上所述，本研究对不明原因的E-ID/DD表型及基因谱的相关性、遗传咨询提供了帮助，离子通道基因在E-ID/DD的发病机制中起着至关重要的作用，与突触形成和功能相关的基因也与E-ID/DD发病密切相关。此外，转录调控、酶调节、细胞代谢和细胞间相互作用中的一些因素也可能参与E-ID/DD的共同发病机制。但本研究未建立蛋白质相关模型，尚不能明确是否有潜在相似调控机制，希望随着基因检测技术的发展，不断完善E-ID/DD诊疗。

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