发育迟缓胚胎培养至D7囊胚行冻融移植成功获得活产1例

何玮，杨梅，石静怡，罗月，李俊林，黄俊俊，张耀△
(绵阳市中心医院生殖医学中心，四川绵阳621000)

1临床资料

患者，女，25岁，未避孕未孕4年，因“双侧输卵管修复整形术后1年未孕”于2019年2月18日就诊。患者平素月经周期不规则，彩超提示双侧卵巢多囊样改变。糖耐量试验及胰岛素释放试验提示胰岛素抵抗，予以二甲双胍预处理。2018年因“下腹反复疼痛3年”在外院行宫腹腔镜手术，术中行双侧输卵管修复整形术＋双侧输卵管系膜囊肿电灼术＋盆腔子宫内膜异位病灶电灼术＋双侧卵巢打孔术＋盆腹腔粘连松解术，术后双侧输卵管通畅。男方在我院检查精液提示畸形精子症，其余常规指标正常。于2019年2月来院要求行试管婴儿助孕治疗。
2019年4月患者进入试管婴儿助孕周期，采用拮抗剂方案进行降调节，取卵日共获得卵母细胞16枚，行短时受精，体外受精4h后脱颗粒细胞观察第二极体(2pb)排出情况，进行早受精判断，拆蛋后观察到2pb排出的卵母细胞有6枚，仅见第一极体(MII)的8枚，未成熟卵(MI)2枚，因排出2pb的卵个数大于总成熟卵母细胞数的30％，故对未排出2pb的成熟卵母细胞没有行补救卵胞浆单精子显微注射(ICSI)，D1观察原核见双原核(2PN)2枚，三原核(3PN)3枚，单原核(1PN)1枚，未见原核可见两个极体(0PN)的有3枚，未受精的7枚，D2卵裂胚5枚，其中2PN(正常受精)来源的卵裂胚1枚，0PN来源的卵裂胚1枚，MII来源的卵裂胚1枚，3PN来源的卵裂胚1枚，D3可利用胚胎仅有1枚(4C3)，为MII来源胚胎，其余均为4级胚胎，丢弃。因可利用胚胎为非正常受精来源胚胎，故与患者充分沟通，知情同意后将4C3胚胎行囊胚培养，D5无囊胚形成，D6形成2期囊胚，考虑患者本周期无可利用胚胎，便延长了体外培养时间，D7形成1个4BB优质囊胚，行人工皱缩后用日本加藤玻璃化冷冻试剂及载体(Kitazato公司)对胚胎进行冷冻保存。
冻融胚胎移植内膜准备：患者于2019年9月拟冻胚移植，采用GnRHa＋HRT方案进行内膜准备，给予亮丙瑞林注射液(GnRH⁃a，上海丽珠制药有限公司产品，3.75mg／支)3．75mg皮下注射，降调节29d后复查阴道B超，内膜4mm，给予雌二醇片／雌二醇地屈孕酮片4mg／d，4d后增至6mg／d，再4d后增至8mg／d；第20天阴道B超见子宫内膜11mm，E2373pg／ml，给予绒毛膜促性腺激素(HCG)6000IU肌肉注射，于次日开始肌注黄体酮注射液60mg／次，1次／d进行内膜转化，内膜转化第6天进行解冻囊胚移植。
囊胚解冻复苏：使用日本加藤玻璃化解冻试剂(Kitazato公司)对D7囊胚(4BB)进行解冻复苏，解冻完成后立即对囊胚行辅助孵化，然后置于37℃、6％CO2的三气培养箱内培养2h后观察囊胚扩张情况并进行评分，移植。移植后继续给予黄体酮注射液进行黄体支持，移植12d查血人绒毛膜促性腺激素(β⁃hCG)值为421IU／L，移植19d查血β⁃hCG值为6470IU／L，移植28dB超检测宫腔内1个孕囊和胎心，内见胎芽、卵黄囊及原始心血管搏动，获得单胎妊娠。孕39＋2周行剖宫产获得1活产健康男婴(体质量3.75kg，身长51cm)。

2讨论

囊胚培养是通过延长体外培养时间，筛选出具有发育潜能胚胎的一种方法，胚胎通常在体外培养至D5~6形成可利用囊胚则视为发育潜能较好的胚胎，如在D7形成囊胚，则视为胚胎发育速度迟缓，考虑胚胎发育潜能低下，妊娠率和着床率较低，所以目前大多数胚胎实验室仍将胚胎常规培养至D5~6，很少将D6未形成囊胚或不可利用囊胚的胚胎继续培养。有研究显示，胚胎在体外培养至D5~6的囊胚形成率约67％，培养至D7的囊胚形成率仅29％[1]。由于D7囊胚发育速度迟缓、胚胎质量差和非整倍体率高使其临床应用的可行性和安全性存在较大争议[2]。伊斯坦布尔共识也指出“囊胚发育延迟(D7或D8)被认为植入预后不良”[3]，所以D6未达到囊胚冷冻标准的胚胎大都会被丢弃。但很多研究表明，D7形成的囊胚也具有一定的临床应用价值[4⁃6]。有文献报道，D5囊胚的整倍体率为54.7％，D6囊胚的整倍体率为52.9％，D7囊胚的整倍体率为40.5％，明显低于D5、D6的囊胚，当在D5或D6未能达到活检标准的胚胎常规进行延长培养至发育的D7时，患者获益[7]，Tiegs等[8]研究表明，虽然D7囊胚的整倍体率较低，但与D5和D6囊胚的持续着床率相似。Niu等[9]也报道，D7优质囊胚比例低于D5或D6，但是在D5、D6和D7之间，非整倍体囊胚发生率差异无统计学意义。与D5或D6囊胚移植相比，D7囊胚移植后获得了类似的临床妊娠、持续妊娠和胚胎植入率。Ueno等[10]首次提出了D7囊胚冷冻标准，即胚胎直径达到180μm即可行冷冻保存，其妊娠结局明显高于D2胚胎移植。
最近，阮秋燕等[11]报道1例冻融移植由D3优质胚胎培养至D7的囊胚，成功获得活产的案例，屈春凤等[12]报道1例非优质胚培养至D7囊胚冻融移植成功获得活产的案例。本病例是在D3无可移植胚胎的情况下，将非正常受精来源(MII)的一个发育迟缓的卵裂期胚胎(4C3)进行囊胚培养，D5无囊胚形成，D6形成2期囊胚，由于该治疗周期无剩余可利用胚胎，故将这个2期囊胚继续培养至D7，形成一个4BB优质囊胚，行玻璃化冷冻保存，数月后拟行冻融胚胎移植(FET)，女方行内膜准备后，囊胚经玻璃化解冻复苏后行移植，FET周期成功妊娠，并顺利生产一足月健康男婴。
通常胚胎实验室会将D6未形成可利用囊胚常规丢弃，通过这个病例结果总结分析，对于治疗周期无胚胎移植或冷冻保存的病例，可以考虑延长培养时间观察是否有可利用囊胚形成，以增加患者妊娠机会。黄亚等[13]研究表明，对于优质囊胚和普通囊胚，囊胚形成时间对活产率无太大影响；对于低评分囊胚，囊胚形成时间延长，其临床妊娠率和活产率会逐步降低。当移植的囊胚为非优胚时，囊胚形成时间对妊娠结局有明显影响，D5囊胚移植的妊娠结局明显优于D6囊胚[14⁃15]。Hammond等[16]认为，虽然D7的囊胚仅占可利用囊胚的5％，但适合冷冻保存或活检的囊胚能获得理想的妊娠结局。
有研究显示，发育迟缓的囊胚在冷冻复苏周期中依然能获得一定的临床妊娠率，但由于体外培养时间的延长，非整倍体率较高，有必要在移植前做非整倍体筛查[17]。由于我院生殖中心暂未开展胚胎植入前遗传学诊断(PGT)技术，我们无法对这部分发育迟缓的囊胚进行非整倍体筛查。有大样本Meta分析结果显示，发育慢的D6囊胚FET后具有与D5囊胚相似的临床妊娠率和持续妊娠／活产率[18]。所以对部分特别珍贵的胚胎，为了让患者的利益最大化，在患者充分知情同意的情况下，我们通过常规的胚胎形态学评分后进行移植，如成功获得临床妊娠，建议患者在孕期做产前诊断，及时评估胎儿的健康状态。
综上，对于辅助生殖助孕患者部分特殊群体，如卵巢功能低下，胚胎发育迟缓，低质量胚胎的患者，在获卵有限的情况下，可以根据患者实际情况适当的延长发育迟缓胚胎的体外培养时间，可增加其治疗周期可利用胚胎数量的机会，为卵裂期无可利用胚胎或低质量胚胎的患者提供了可妊娠的机会，也为患者节约了时间成本和经济成本，具有一定的临床应用价值。

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