全外显子测序在语言发育迟缓、障碍儿童早期诊断中的应用

王建红 1谢华 2 许琪 1 田宇 1 王曦 1 上官少方 2 张裕 2 卢贺阳 1陈晓丽 2

王琳 11 首都儿科研究所附属儿童医院保健科，北京 100020；2 首都儿科研究所遗传研究室， 北京 

【摘要】 目的评估全外显子测序技术（WES）对儿童语言发育迟缓/障碍的早期诊断价值 。 方法回顾性研究 。选取 2019 年 1 月至 2020 年 12 月于首都儿科研究所附属儿童医院保健科就诊的语言发育迟缓/障碍患儿为研究对象 。知情同意基础上采集患儿和父母外周血进行 WES，结合患儿的临床表型筛选候选变异，包括单核苷酸突变（SNVs）和基因拷贝数变异（CNVs）。候选变异利用 Sanger测序/real‑time PCR/CNV‑Seq 完成验证和家系分离分析，最终根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南完成致病性评估和遗传诊断 。对其中完成《儿童神经心理行为检查量表 2016 版》检查的125 例患儿，以 WES 检测结果阳/阴性分组，采用 t 检验比较两组患儿总发育商、大运动、精细动作、适应能力、语言和社会行为能区的发育水平 。结果165 例语言发育迟缓/障碍患儿完成 WES 检测，男女比例为 1.95∶1，男童 109 例，女童 56 例，年龄（3.2±1.2）岁、中位数 3.0 岁，共检测出与疾病相关的致病性突变者 45 例，阳性诊断率为 27.3%（45/165）。其中 36 例检测到的变异为 SNVs，9 例为 CNVs 。家系成员的变异来源检测显示新发突变在致病性基因变异中占比为 86%（31/36）。 女童的阳性诊断率45%（25/56），显著高于男童（ 18.3%、20/109，χ² = 12.171，P<0.05）；各年龄段的阳性诊断率无显著差异(χ²=4.349，P>0.05）；WES 检测阳性组患儿大运动发育商均值低于阴性组（61.5±15.39 vs. 69.4±14.36）， 差异有统计学意义（t=-2.610，P<0.05）；两组患儿在精细动作、适应能力、语言、社会行为能区发育商的差异无统计学意义（t=-0.933、- 1.298、-0.114、-0.214，P 均>0.05）。 结论语言发育迟缓/障碍具有复杂的遗传异质性，WES 在全外显子层面对语言发育迟缓/障碍儿童的早期病因诊断具有重要价值。

【关键词】 儿童 ； 语言障碍 ； 外显子 ； 测序

基金项目：北京市自然科学基金（7202019）；国家自然科学基金（31671310，81873633，82071276）； 北 京 市 属 医 学 科 研 院 所 公 益 发 展 改 革 试 点 项 目（京 医 研 2019‑11）；首 都 卫 生 发 展 科 研 专 项（2020‑2‑1131，2020‑2‑2104）；北京市医管局培育项目（PX2020056）

通信作者：王琳

引用本文：王建红, 谢华, 许琪, 等 . 全外显子测序在语言发育迟缓/障碍儿童早期诊断中的应用[J]. 中华 预防医学杂志,

前言

原发性的语言发育迟缓/障碍是一种神经发育障碍性疾病［ 1 ］，又称之为特定型语言障碍或者发育性语言障碍，与遗传基因 、神经功能 、养育状况等多种生物及环境因素相关［2］。然而 ，语言发育迟缓/障碍也常伴随其他多种神经发育障碍性疾病等，为这些疾病的早期或者部分表现，如听力异常、孤独症谱系障碍、智力障碍等［3‑4］。 因此，对语言发育迟缓/障碍患儿进行早期全面评估及病因检查是识别疾病、明确诊断及合理干预的前提。

目前国内关于本病诊断多以症状诊断为主［5 ］，关于其病因方面探究较少 。随着人类基因组测序完成 ，全 外 显 子 测 序 技 术（whole‑exome sequencing，WES）已广泛应用于临床遗传性疾病的诊断［6］，这些进展为语言发育迟缓/障碍患儿早期病因的探究提供了新的线索 。本研究通过回顾性分析语言

发育迟缓/障碍患儿的临床资料及全外显子测序结果，探讨全外显子测序在其早期诊断中的作用，为该类患儿选择适宜检测方法 、遗传学病因及预本研究获得首都儿科研究所伦理委员会批准。 所有患儿在参加全外显子测 序前均已由监护人签署书面知情同意书并同意检测。

方法

1. 神经心理发育测查：采用《儿童神经心理行 为检查量表 2016 版》［9］，由经过该量表标准化培训 的专业测查人员对患儿进行神经心理发育测查，计 算总发育商、大运动、精细动作、适应能力、语言和 社会行为能区的发育商 。依据该量表应用的参考 分 值 ，发 育 商 ≥80 分 为 正 常 ；70~79 分 为 临 界 偏 低；<70 分为发育迟缓/障碍。

2. 全外显子组测序：

（ 1）DNA 提取：EDTA 抗凝采血管采集患儿及 父母的外周静脉血各 5 ml，-20 ℃保存 。采用全血 基因组 DNA 提取试剂盒（北京康为世纪生物科技 有限公司，CWE 9600）提取血液 DNA。

（2）文库构建及全外显子测序：取 0.75 μg DNA 样本经超声破碎仪（新芝 SCIENTZ08‑Ⅲ)打断，得 到 200~300 bp 的 DNA 片 段 。 采 用 KAPALibrary Preparation Kit 试 剂（KAPA KK8234）构 建 DNA 文 库 。真空浓缩的 DNA 文库样本经杂交捕获后进行 Illumina NovaSeq 高通量测序 。为确保 WES 达到临 床检测目的，要求每个样本的测序数据确保大于 10 G，平均测序深度大于 100x，基因组参考序列比 对后，20x 深度以上的区域占目标总区域的比例大 于 95%，以上质量不合格则重新构建文库或增加 测序。

（3）变异筛选和家系分离验证等：测序数据经Illumina 测序仪自带软件评估合格后，利用公共数据库（ 1k Genome，ExAC，gnomAD）和实验室内部数 据 库 对 基 因 单 核 苷 酸 变 异（single nucleotidevariants，SNVs）进行变异人群携带率注释，同时使用 生 物 信 息 学 软 件（MutationTaster，PROVEAN， Polyphen‑2，REVEL）对错义变异危害性进行注释， 确定基因变异导致的蛋白功能改变 。对于隐性遗传病的致病基因，如果该基因变异的最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF），在实验室内部数据库、东亚人群>3%，则标注为常见多态性变异； 对于显性遗传病的致病基因 ，如果该基因变异MAF>1%，则标注为常见多态性变异；对于错义变异，如果有 2 个或 2 个以上软件预测该基因变异具有危害性（deleterious effect），则标注为影响基因功

能的危害性变异；将编码区±2位点称为经典剪切位点，同时采用其他软件（human splicing finder）寻找非经典剪切位点 。根据以上流程筛选出临床表型相关的罕见危害性变异，然后结合患者表型利用降 落 式 聚 合 酶 链 式 反 应（touchdownpolymerasechain reaction，TD‑PCR）结合 Sanger 测序进行核心家系成员（父母和同胞）验证，保留家系成员共分离的变异位点 。根据美国医学遗传学与基因组学学会（American Collegeof Medical Genetics and Genomics，ACMG）的基因单核苷酸变异解读指南完成致病性评估 ［10］。 临床医生在患者复诊过程中，结合临床表型和基因检测报告，在临床表型和基因相关疾病描述一致前提下完成临床遗传诊断。 新生突变的家系成员都利用 STR 完成生物学父母关系鉴定，确保其符合 PS2 证据。

同时利用 NextGENe 软件自带程序分析基因组 拷贝数变异（copy number variants，CNVs），即利用 同一测序 Lane 内同性别的测序数据比较测序深度 计 算 出 Log2ratio ，该 比 值 >1.25 标 注 为 可 能 重 复 ，<0.75 标 注 为 可 能 缺 失 。 采 用 CNV‑Seq 或 real‑time PCR 对变异进行真实性验证 。筛查出大 于 500 kb 的基因组 CNV，然后比对 DVG 数据库过 滤掉常见良性 CNVs，对于罕见 CNVs，根据 ACMG 关于基因组拷贝数变异解读指南完成致病性评 估［11］。携带致病性或可能致病性 SNVs/CNVs 的患 儿都属于诊断阳性组。

统计学分析

Epidata3. 1 建库，将研究对象病历资料录入数据库，SPSS19.0 软件进行统计学描述和分析，符合正态分布的计量资料以  ± s 表示，计数资料以“例（%）”表示；采用 χ²检验分析不同性别患儿 WES 阳性诊断率的差异，采用 t 检验比较 WES 检测结果阳/阴性患儿总发育商、大运动、精细动作、适应能力、 语言和社会行为能区发育商的差异 。双侧检验，检验水准 α=0.05。

结果

一、语言发育迟缓/障碍儿童队列的基本信息

2019 年 1 月至 2020 年 12 月符合纳入标准的语 言 发 育 迟 缓/障 碍 患 儿 165 例 ，其 中 男 109 例 ，女 56 例，男女比例为 1.95∶1，年龄为（3.2±1.2）岁、中位 数 3.0 岁 。各年龄组人数比例分别为 1~<2 岁 15.2% （25/165）、2~ <3 岁 31.5%（52/165）、3~ <4 岁 26. 1% （43/165）、4~ <5 岁 17.0%（28/165）、5~ <6 岁 10.3%17/165），2~4 岁儿童比例最多。

165 例患儿检测出与疾病相关的致病性突变者 45 例，其中 36 例为 SNVs，9 例为 CNVs，阳性诊断率为 27.3%（45/165）；男童的阳性诊断率为 18.3%（20/109），女童的阳性诊断率为 45%（25/56），女童高 于 男 童 ，差 异 有 统 计 学 意 义(χ² = 12.171，P=0.001 ）；各 年 龄 组 患 儿 的 阳 性 诊 断 率 分 别 为 ：1~ <2 岁 36%（9/25），2~ <3 岁 17%（9/52），3~ <4 岁 28%（ 12/43 ），4~ <5 岁 32%（ 9/28 ），5~ <6 岁 35% （ 6/17），各年龄组间阳性诊断率比较显示差异无统 计学意义(χ²=4.349，P=0.361）。

二 、语言发育迟缓/障碍儿童队列的单核苷酸 变异的遗传特点

所有样本都达到 WES 临床检测的质量要求 。表 1语言发育迟缓/障碍儿童中致病性 SNVs 的遗传学特征

四、WES 检测结果阳性/阴性患儿总发育商及 不同能区发育商的比较

本研究中有 125 例患儿进行《儿童神经心理行为检查量表 2016 版》的神经心理发育测查 。其中， WES 检测阳性患儿 35 例，男 16 例，女 19 例，年龄（3.2±1.3）岁 、中 位 数 3.0 岁 ；WES 检 测 阴 性 患 儿90 例，男 69 例，女 21 例，年龄（3.2±1.2）岁 、中位数3.0 岁；两组年龄构成比较，差异无统计学意义（t=0.261，P= 0.794）。 两组患儿的总发育商及各能区发育商均<70 分，两组比较显示：WES 检测阳性组患儿的大运动发育商均值低于 WES 检测阴性组，神经发育障碍疾病的早期症状，很难通过特征表型确定候选基因［7，13］，因此从基因组层面（如全编码区测序和全基因组测序）筛查致病性变异，才能精准探索儿童语言发育迟缓/障碍的遗传物质基础 。 基于此，本研究对存在语言发育迟缓/障碍的 1~6 岁患儿进行了 WES 检测以期对其遗传病因进行探究 ，结 果 发 现 WES 对 该 类 疾 病 的 阳 性 诊 断 率 为27.3%，与其在不明原因智力低下患者中 24%~33%的阳性诊断率相当［14］。其中，1~<2 岁患儿中致病性突变的诊断率为 36%，在各年龄组中最高，提示基因突变引起的先天性语言发育迟缓患者起病较早，后期需要更大样本量研究验证发病年龄和致病性变异的关系。

经 WES 检测出的 36 例携带致病性 SNVs 中，存 在各类神经发育障碍相关基因 。其中携带明确语 言障碍相关的 FOXP2基因变异 1 例，孤独症谱系障 碍［15‑16］相 关 的 SHANK3、SCN2A、CHD8 基 因 变 异 4 例，Rett 综合征相关的 MECP2基因变异 1 例，先天 性糖基化病 IIi 型相关的 COG5基因变异 1 例 。不仅早期确诊了孤独症谱系障碍这类神经发育障碍性 疾病，并检测出临床表型不典型、罕见的先天性糖 基化病 IIi 型 。在早期明确诊断的同时也为疾病的 治疗及判断预后提供了重要依据［17］。本研究中 WES 亦发现 9 例可疑 CNVs，后经全基因组 CNV 芯 片检测均确定存在与疾病相关的致病性 CNVs，表表3WES 检测结果阳性/阴性患儿总发育商及不同能区发育商的比较（分， ± s）明 WES 对于提示 CNVs 具有很好的诊断价值，提高了疾病诊断率［6］。但 WES 技术检测也存在一定的局限性，对于假基因、动态突变，以及内含子区域等无法检测［18］。随着测序成本的降低和生物信息分析能力的优化，覆盖全部基因的外显子、内含子和基 因 间 序 列 的 全 基 因 组 测 序（wholegenomesequencing，WGS）技术有望应用于临床遗传检测， 帮助临床完成精准诊断并提高病因诊断率［19］。另外，在 WES 分析过程中注重采集患者表型，利用规范 的 人 类 表 型 术 语（Human Phenotype Ontology， HPO）描述临床表型，将有助于对应基因变异的临床解读 。最新 ACMG 指南中关于 PS2 和 PS1 证据中都提到需要结合临床表型，在本研究中，我们对实验室发现的致病性或疑似致病性变异的患者，都重新进行临床回访，在临床表型和基因型符合前提下完成遗传诊断。

儿童全面的神经心理发育评估可发现除语言发育问题以外的其他身体和发育问题［2］。本研究比较 WES 结果阳性患儿及结果阴性患儿在神经心理发育评估中的差异，旨在了解患儿全面发育特点的同时，探索其差异，以期为临床选择 WES 检测提供依据 。结果显示两组儿童大运动能区发育商存在显著差异，总发育商、精细动作、适应能力、语言、 社会行为能区发育商无差异 。儿童精细动作的发展与表达性语言的发展呈正相关［20‑21］，适应能力反映儿童对外界信息的感知、注意、记忆和思考等心理活动及解决问题的能力［22］，影响着语言的发展， 同时语言发展也影响个人社交技能发展，对于同时存在语言发育迟缓/障碍的两组患儿，这些能区的发展上无明显差异 。但在与语言发育无明显相关的大运动能区上存在显著差异，提示在以语言发育迟缓/障碍为主要特征的患儿，应注意评估其语言发育问题以外的身体和发育特征，也在一定程度上提示了存在其他非语言相关发育异常的语言发育迟缓/障碍患儿，进行 WES 的阳性率会更高 。Buja等对孤独症谱系障碍个体的研究也显示了类似的结论：孤独症谱系障碍个体基因上的新发致病性突变也与受损的运动技能明显相关［23］。

本研究发现语言发育迟缓/障碍的儿童中，女 童的致病性变异携带率明显高于男童，这个结论和 近几年国际提出的“神经发育障碍的女性保护效 应 ”一致［24］。女性保护机制体现在 3 个方面：（ 1）和 男性患者相比，女性患者需要累计更多危害性基因变异才得病；（2）男性患者的致病性变异来自表型正常或很轻微的母亲；（3）女性患者的致病性变异 的产率要高于男性患者，即呈现单基因遗传模式的 女性患者多于男性 。关于机制尚不清晰，可能和哺 乳动物的婴幼儿期，尤其人类需要母亲进行照顾有 关 。在我们的既往研究中利用 1 万多例中国发育 障碍儿童的染色体芯片也证实神经发育障碍存在 女性保护效应。

综上所述

本文对语言发育迟缓/障碍儿童遗 传学病因进行了探究，同时对发育测查结果与致病 性基因之间的关系进行了探讨 。WES 在儿童语言 发育迟缓/障碍早期诊断中具有重要的价值 。随着 未知意义的变异被发现和临床定义，WES 将成为 一种临床上常用的有效的评估方法，用于不明显符 合特定遗传综合征的表型的疾病，对未来的干预治 疗和预后提供指导 。语言发育迟缓/障碍患儿的 WES 结果显示其具有复杂的遗传异质性，这也提 示临床医生对于此类患儿应进行早期全面评估及病因检查。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献

[1]美国精神医学学会 . 精神障碍诊断与统计手册[M]. 张道龙, 刘春宇, 童慧琦, 等, 译 . 5版 . 北京:北京大学出版社, 2015: 38‑40.

[2]McLaughlin MR. Speech and language delay in children[J]. Am Fam Physician, 2011, 83 (10): 1183‑1188.

[3]OzyurtG,ElikucukCD.ComparisonofLanguageFeatures,AutismSpectrumSymptomsinChildrenDiagnosed with AutismSpectrumDisorder,DevelopmentalLanguage Delay, andHealthyControls[J].NoroPsikiyatr Ars,2018, 55 (3): 205‑210. DOI: 10.5152/npa.2017.19407.

[4]Zengin‑AkkusP,Celen‑YoldasT,KurtipekG,et al.Speech delay in toddlers: Are they only‘late talkers ’?[J]. Turk J Pediatr,2018,60 (2):165‑172.DOI:10.24953/ turkjped.2018.02.008.

[5]张庆苏 . 语言发育迟缓的基本概念与内涵[J]. 中国听力语 言康复科学杂志 , 2019, 17 (4): 308‑310. DOI: 10.3969/j. issn.1672‑4933.2019.04.018.

[6]谢华,吕凌云, 高志杰, 等 . 探索全外显子测序在儿童神经发 育障碍中的诊断价值[J]. 中华检验医学杂志, 2017, 40(8): 623‑629. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009‑9158.2017.08.014.

[7]FeldmanHM.Howyoungchildrenlearnlanguageandspeech[J].PediatrRev,2019,40(8):398‑411.DOI: 10.1542/pir.2017‑0325.

[8] Luinge MR, Post WJ, WitHP, et al. Theordering of milestones in languagedevelopment forchildren from1 to 6 years of age[J]. J Speech Lang Hear Res, 2006, 49 (5): 923‑940. DOI: 10.1044/ 1092‑4388 (2006/067).

[9]金春华 . 儿童神经心理行为检查量表(2016版)[M]. 北京:北 京出版社, 2016: 23, 48.

[10]RichardsS, AzizN,Bale S, et al.Standards and guidelines for theinterpretation ofsequence variants:a jointconsensusrecommendationoftheAmericanCollegeof MedicalGeneticsandGenomicsandtheAssociationfor Molecular Pathology[J]. Genet Med, 2015, 17 (5): 405‑424. DOI: 10.1038/gim.2015.30.

[11] Riggs ER,AndersenEF, CherryAM, et al.Technicalstandardsforthe interpretationandreporting of constitutionalcopy‑numbervariants:ajoint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics(ACMG) and the Clinical Genome Resource(ClinGen)[J]. Genet Med, 2020, 22 (2): 245‑257. DOI: 10.1038/s41436‑019‑0686‑8.

[12]陶舒曼, 陶芳标 . 孕期环境暴露与儿童发育和健康[J]. 中华 预防医学杂志, 2016, 50 (2): 192‑197. DOI: 10.3760/cma.j. issn.0253‑9624.2016.02.018.

[13]GrigorenkoEL.SpeakinggenesorgenesforspeakingDecipheringthegeneticsofspeechandlanguage[J].J Child Psychol Psychiatry, 2009, 50 (1‑2):116‑125. DOI: 10.1111/j.1469‑7610.2008.02006.x.

[14]StudyDDD.Large‑scalediscovery of novel genetic causes of developmentaldisorders[J].Nature,2015,519 (7542): 223‑228. DOI: 10.1038/nature 14135.

[15]RylaarsdamL,Guemez‑GamboaA.GeneticcausesandmodifiersofAutismspectrumdisorder[J].Front Cell Neurosci, 2019, 13: 385. DOI: 10.3389/fncel.2019.00385.

[16]SprattPWE,Ben‑ShalomR,KeeshenCM,etal.TheAutism‑AssociatedGeneScn2aContributestoDendriticExcitability and Synaptic Function in the Prefrontal Cortex [J]. Neuron, 2019, 103 (4):673‑685. e675. DOI: 10.1016/j. neuron.2019.05.037.

[17]HurdPJ,NelsonCJ.Advantagesofnext‑generation sequencing versus the microarrayinepigenetic research [J]. Brief Funct Genomic Proteomic, 2009, 8 (3):174‑183. DOI: 10.1093/bfgp/elp013

[18] Meienberg J,BruggmannR,OexleK,et al.Clinical sequencing: is WGS the better WES? [J]. Hum Genet, 2016, 135 (3):359‑362. DOI:10.1007/s00439‑015‑1631‑9.

[19] Lionel AC,CostainG,MonfaredN,et al.Improved diagnostic yield compared with targeted gene sequencing panels suggests a role for whole‑genome sequencing as a first‑tier genetic test [J]. Genet Med, 2018, 20 (4):435‑443. DOI:10.1038/gim.2017.119.

[20]FrezzatoRC,SantosDC,GotoMM,et al.Fine motor skillsand expressive language: a study with children with congenital hypotyreoidism[J]. Codas, 2017, 29 (1): e20160064‑e20160070. 

[21]ChoiB,LeechKA,Tager‑FlusbergH,etal.Developmentoinemotorskillsisassociatedwithexpressivelanguage outcomes in infants athigh and low risk for autism spectrumdisorder[J].JNeurodevDisord,2018, 10 (1): 14‑24. DOI: 10.1186/s11689‑018‑9231‑3.

[22]邹小兵, 静进 . 发育行为儿科学[M]. 北京:人民卫生出版社, 2005: 368‑379.